DB6540/T 022-2023 马红球菌PCR检测方法

ICS65.020.30

CCSB41

6540

伊犁哈萨克自治州地方标准

DB6540/T022—2023

马红球菌PCR检测方法

PCRtestmethodforstreptococcusequi

2023-10-30发布2023-11-30实施

伊犁哈萨克自治州市场监督管理局发布

DB6540/T022—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由昭苏县西域马业有限责任公司提出。

本文件由伊犁州畜牧兽医局归口并组织实施。

本文件起草单位：昭苏县西域马业有限责任公司、新疆农业大学、昭苏县畜牧兽医发展中心、中国

农业大学、伊犁哈萨克自治州昭苏马场、新疆维吾尔自治区地方国营伊犁种马场、乌鲁木齐市动物疾病

控制与诊断中心、新疆农业职业技术学院、尼勒克县胡吉尔台乡畜牧业发展中心。

本文件主要起草人：马玉辉、吕燕、李海、赵红琼、刘璐、余万里、余海、叶斯哈提·胡安、芦文

圆、付强、马思远、刘来珍、苏艳、郝智慧、邓海峰、郑文祥、夏利宁、马雪连、王金泉、姚刚、蔡扩

军、蔡鹏、蔡涛、顾伟芳、雷艳、倪艳、江阿拜•居玛德勒汗。

I

DB6540/T022—2023

马红球菌PCR检测方法

1范围

本文件规定了马红球菌的PCR检测方法。

本文件适用于马匹上呼吸道渗出物（鼻拭子）及粪便（肛拭子）样本中马红球菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

马红球菌rhodococcusequi,R.equi

R.equi属放线菌目、诺卡菌科、红球菌属。该菌是一种革兰阳性兼性胞内寄生球杆菌，耐酸，无

孢子，大多无鞭毛。R.equi可以在肺泡巨噬细胞中存活并复制，导致不同动物物种和人发生肺部和肺

外化脓肉芽肿感染。

聚合酶链式反应polymerasechainreaction,PCR

体外酶催化合成特异DNA片段的方法，模板先经高温变性为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条

件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列退火而相互结合，接

着在DNA聚合酶的作用下以4种dNTPs为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循

环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

R.equi：马红球菌(Rhodococcusequi)

ChoE：胆固醇氧化酶(Cholesteroloxidase)

VapA：毒力相关脂蛋白(Virulence-AssociatedProteinA)

DNA：脱氧核糖核酸(Desoxyribonucleicacid)

PCR：聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction)

dNTP：脱氧核苷酸三磷酸(Deoxynucleotidetriphosphate)

ddH2O：双蒸水(Doubledistilledwater)

1

DB6540/T022—2023

Taq：水生栖热菌(Thermusaquaticu)

5生物安全措施

为了保护实验室人员的安全，所有培养物和废弃物应小心处置。并按照GB19489中的有关规定进行。

6诊断方法

主要设备、试剂及耗材

冰箱、速冷冻离心机、恒温水浴锅、混匀器、高压灭菌器、电子天平、PCR仪、电泳仪、凝胶成像

系统、移液器（10μL，100μL，1000μL）、一次性吸头（10μL，100μL，1000μL）、PCR管、

一次性使用采样器（拭子）、50%（体积比）甘油、胰酪大豆胨琼脂培养基、胰蛋白胨大豆肉汤、细菌

基因组DNA提取试剂盒、TE缓冲液、琼脂糖、TAE电泳缓冲液、溴化乙锭、DNAladder、PCR扩增相关试

剂（详见附录A）。

样本采集、保存

6.2.1样本采集器具

采样器具为一次性无菌产品，一套清洁采样工具仅限一个样本使用。存放样本的容器应清洗干净，

121℃20min灭菌后使用，或为一次性使用无菌容器。

6.2.2样本采集步骤

采样人员将马匹保定，将一次性使用采样器轻轻插入马匹咽腔、鼻腔或肛门（鼻腔深度约为8c