GB/T 28978-2012 马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法

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中华人民共和国国彖标准

GB/T28978—2012

马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法

DetectionandidentificationofClavibactermichiganensissubsp.sepedonicus

2012-12-31发布2013-06-01实施

GB/T289782012

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本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国福建

出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。

本标准主要起草人:廖富荣、林石明、吴媛、沈建国、吴志毅、陈青、张明哲、陈红运、黄蓬英。

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GB/T289782012

马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法

1范围

本标准规定了基于生理生化特性、致病性特征、血清学、分子生物学特征的马铃薯环腐病菌检测和

鉴定方法。

本标准适用于马铃薯环腐病菌在马铃薯块茎、植株上的检测与鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

SN/T1135.5—2007马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法

3马铃薯环腐病菌基本信息

中文名称:密执安棒状杆菌环腐亚种

俗名：马铃薯环腐病菌

拉丁学名tClavibactermichi^anensissubsp.sel)edonicus

属于微杆菌科(Microbacteriaceae、棒形杆菌属(Clavibacter)的成员。

马铃薯环腐病菌(以下简称Cms引起马铃薯环腐病，可通过带病的种薯进行远距离传播，也报道

可通过番茄等种子传播，关于Cms的其他信息参见附录A。

4方法原理

马铃薯环腐病菌具有独特的培养性状和生理生化特征，该病菌的生理生化特性、致病性特征，以及

血清学、分子生物学特征是制定本标准的主要依据。

5主要仪器设备

本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备：

微量榨汁机、酶标仪、洗板机、微量天平(感量：0.001g、生物培养箱、荧光显微镜、PCR仪、荧光

PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、BI()L()G自动微生物鉴定系统、浊度

计、水浴槽或恒温孵育器、pH计、各种量程的可调移液器(1000卩L、200卩L、100卩L、20MU10”L、2(«L0

6检测与鉴定

6.1症状检查

马铃薯环腐病菌侵染马铃薯植株后，在马铃薯块茎、植株上可产生症状(参见附录A),通过症状检

查可以初步判断是否为Cms引起的病害。

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6.2表现症状样品中病原菌的分离

6.2.1培养基的选择

从马铃薯块茎、茎杆、叶片等植物组织中分离病原菌选择用MTNA培养基（见B.1）或NCP-88培

养基（见B.2）,用酵母葡萄糖矿物盐培养基（YGM）（见B.3）或葡萄糖营养琼脂（NDA）（见B.4）进一步

纯化。

6.2.2分离纯化

按附录C给出的方法,从发病的植物组织中分离病原菌。当分离到疑似Cms的纯培养后，6.4~

6.6给出的方法进行鉴定，然后6.7给出的方法进行致病性测定。

6.3潜伏侵染样品初筛与分离

6.3.1样品制备

按附录D的给出的方法，每份检测样品取200个马铃薯块茎，洗涤去除表面土壤后，切取维管束组

织制备马铃薯块茎悬浮液。

6.3.2初筛检测

利用DAS-ELISA方法（6.5给出的方法）对制备马铃薯块茎悬浮液进行初筛检测。如果DAS-

ELISA检测结果为阳性的，则用RT-PCR方法（6.6.1给出的方法）进行验证。

6.3.3生物学测定

把初筛检测阳性的马铃薯块茎悬浮液接种到感病的茄子上，进行生物学测定（6.7给出的方法）。

6.3.4分离纯化

按附录C给出的方法，把初筛检测阳性的马铃薯块茎悬浮液进行系列稀释（10-\10^2JO"3）,分

别取100卩L涂布到MTNA培养基（见B.1）或NCP-88培养基中（见B.2）上进行分离培养。

对疑似Cms菌落6.4—6.6给出的方法进行鉴定，然后6.7给出的方法进行致病性测定。

注：分离纯化可以和生物学测定平行进行。

6.4BIOLOG鉴定

按附录E给出的方法,把疑似Cms的纯培养接种到BUG培养基（见B.7）上富集培养，然后接种到

GENHI鉴定板上进行鉴定。

6.5DAS-ELISA检测

对于表现症状的植物组织样品，1:10的比例（质量：体积）在检测样品中加入样品提取缓冲液

（见B.10）,研磨成匀浆后，离心，上清液作为检测样品。

对于已分离纯化的细菌纯培养，用样品提取缓冲液（见B.10）制备约106CFU/mL的菌悬液作为

检测样品。

对于潜伏侵染的植物组织样品，制成样品悬浮液后（见附录D）,用样品悬浮液进行检测。

按试剂操作说明书或SN/T1135.5—2007中5.2给出的试验方法。用Cms已知菌株作阳性对

照，并设置相应的阴性对照。

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6.6分子生物学检测

6.6.1PCR检测

本标准提供多个检测Cms的PCR方法.任意选用其中一种PCR法进行检测，F.1和F.2给出

的方法。用Cms已知菌株作阳性对照，并设置相应的阴性对照和空白对照。

6.6.2实时荧光PCR检测

本标准提供2个检测Cms的实时荧光PCR方法，任意选用其中一种方法进行检测，F.1和F.3

给出的方法。用Cms已知菌株作阳性对照，并设置相应的阴性对照和空白对照。

6.7致病性测定

按附录G给出的方法,把培养3d的纯培养物制备成约106CFU/mL菌悬液，接种到5~10株茄子

幼苗的茎杆上。用新鲜配制的马铃薯环腐病菌已知菌株制备成约O5CFU/mL〜10”CFU/mL的菌悬

液作为阳性对照，接种5株茄子幼苗。用无菌水作为阴性对照，接种5株茄子幼苗。

7结果判定与报告

7.1结果判定

7.1.1当BIOLOG检测或DAS-EILS检测或分子生物学检测（PCR方法或实时荧光PCR方法），其中

两种基于不同原理的方法检测结果为阳性、且致病性测定为阳性时，判定为马铃薯环腐病菌。

7.1.2当DAS-EILSA检测或分子生物学检测（PCR方法或实时荧光PCR方法）初筛检测结果为阴

性，或只有其中一种检测方法结果为阳性时，判定为非马铃薯环腐病菌。

7.2结果记录与保存

7.2.1记录各项实验数据,包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等。DAS-ELISA检测结

果保存吸光值的数据报告,PCR检测结果保存电泳照片，实时荧光PCR检测结果保存采集的数据。

7.2.2检出马铃薯环腐病菌的马铃薯块茎、茎秆、或叶片等样品，在超低温冰箱中保存，以备复核;分离

纯化的马铃薯环腐病菌保存到超低温冰箱中，或冻干后低温保存。

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附录A

(资料性附录)

马铃薯环腐病菌相关信息

A.1名称与分类地位

中文名称：密执安棒形杆菌马铃薯环腐亚种、密执安棒形杆菌环腐亚种、密执安棍状杆菌环腐亚种

拉丁名称：C7ap“ac/ermichi^atietisissubsp.sepedonicus(Speeckermann&Kotthof,1914

Davis,Gillaspie,Vidaver&Harris1984.

同物异名：Co厂iwebac/e?""加michi^anensissubsp.sepedonicum(SpieckermannKotthof,1914

Carlson&Vidaver,1982;CorynebacIeriuininichi^anensispv.sepedtmicuin(Spieckermann&

Kotthof,1914Dye&•Kemp1977；Corynebacteriumsepedonicum(Spieckermann&Kotthof,1914

Skaptason&Burkholder1942.

俗称：马铃薯环腐病菌

英文名称：Potatoringrot；bacterialringrotofpotato；ringrotofpotato；vascularpotatowilt

英文缩写:CMS或Cms

分类地位：细菌界(Bacteria，厚壁菌门(Firmicutes，放线菌纲(Actinobacteria，放线菌亚纲(Acti-

nobacteridae，放线菌目(Actinomycetales,微球菌亚目(Micrococcineae，微杆菌科(Microbacteriaceae),

棒形杆菌属CClavibacter')

A.2症状特征

A.2.1马铃薯块茎

A.2.1.1马铃薯块茎上的症状

块茎外部症状不明显，但横切后可看到维管束变为乳黄色以至黑褐色，重病薯维管束变色部分可连

成一圈、成环状，严重时皮层与髓部可以脱离。腐烂通常是从顶端的维管组织到块茎的中心皮层逐步发

展的。用手挤压切开的病薯，可看到维管束部分有乳白色或黄色菌液流出。经越冬贮藏的病薯,芽眼干

枯变黑或外表开裂。在病害晚期，由于次生菌的进一步侵染，维管束也可变黑并腐烂。

A.2.1.2与青枯病(褐腐病)的区别

与茄科劳尔氏菌(Ralstojiiasolanacearum)引起的青枯病(褐腐病)区别在于：在病害早期，马铃薯

环腐病腐烂组织通常保持乳白色、具粘稠的奶酪状特征，而马铃薯褐腐病腐烂组织呈褐色、更加粘稠、软

泥状。

A.2.1.3与黑茎病的区别

与胡萝卜软腐欧文氏菌马铃薯黑胫亚种(Erwiniacarotovorasubsp.atroseptica)引起的黑茎病区

别在于:黑茎病在块茎上腐烂成粘团状，腐烂始于脐部，呈放射状向髓部扩展，病部黑褐色，横切可见维

管束亦呈黑褐色，用手压挤皮肉不分离，湿度大时，薯块变为黑褐色，腐烂发臭。

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A.2.2马铃薯植株

A.2.2.1马铃薯植株上的症状

在田间，马铃薯环腐病在植株上的症状有时很少被发现，经常只出现在季节的末期。该症状很容易

被其他病害、衰老或机械损伤等混淆，所以在现场检验时很容易被遗漏。马铃薯环腐病引起萎鳶症状很

少出现，只是叶片和块茎变小，偶尔植株矮化。环腐病引起萎蔦通常是缓慢的，最初只局限于叶缘。感

染的嫩叶经常依旧展开,造成不成对的叶片。受侵染的叶片木质部堵塞，经常在脉间区域产生褪绿、黄

色到橙色，进一步向下影响到茎杆。受感染的小叶、叶片、甚至茎杆，最终可能死亡。

A.2.2.2与其他病害的区别

茄科劳尔氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种、胡萝卜软腐欧文氏菌马铃薯黑胫亚种

(E.carotovorasubsp.atroseptica)、菊欧文氏菌(E.chrysatithem，)、孔状短小茎点霉(Phomaexigua

var.foveala)等系统性病原也可以引起萎鳶症状，与马铃薯环腐病菌引起的萎薦症状的区別是：

——菊欧文氏菌侵染可以使茎杆变黑，而马铃薯环腐病菌不会使茎秆变黑。

一其他几种病菌引起的萎蔦症状是使整个叶片或整个植株快速萎蔦，而马铃薯环腐病菌不会引

起快速萎蔦。

A.3寄主范围

在自然条件下，只侵染马铃薯(.Solanurntuberosum)0甜菜(％/a-vulgaris｝被认为也是该病菌的自

然寄主，但不表现症状。人T接种可以侵染西红柿(Lycopersiconesculentum)茄子(Solanummelon-

gena)、酷栗番茄(Lycopersiconpi/npi?ielIifolium^)等茄科(Solanaceae植物，并都表现症状。

A.4分布

欧洲：奥地利、白俄罗斯、塞浦路斯、捷克共和国、丹麦、爱沙尼亚、芬兰、德国、希腊、拉脱维亚、立陶

宛、荷兰、挪威、波兰、罗马尼亚、俄罗斯、斯洛伐克、瑞典、乌克兰、英国。

亚洲：中国、日本、哈萨克斯坦、韩国、朝鲜、尼泊尔、乌兹别克斯坦。

非洲：阿尔及利亚。

北美洲：加拿大、美国。

A.5形态特征

菌体棍棒状，球形，或卵圆形，单生或双呈“V”形，有时排列成栅栏状，大小(0.4艸〜0.6(«m)X

(0.8Mm~1.2Mmo不产生芽抱，无荚膜,无鞭毛，不能运动。该病菌革兰氏呈阳性,老龄菌易变为阴性。

A.6培养性状

该病菌生长最低温度1°C〜2°C,最高温度31°C〜33°C，生长最适温度为20°C〜23°C,在温度

55工条件下经10min致死，生长最适pH值为&0〜&4。该病菌具有生理分化现象。

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A.7生理生化特性

马铃薯环腐病菌的生理生化特征见表A.lo

表A.1用于马铃薯环腐病菌鉴定的营养和生理性状特征

测试反应

氧化发酵测试(Oxidativeandfermentativetest>O/F惰性的或微弱的氧化反应

氧化酶测试(Oxidasetest一

过氧化氢酶测试(Catalasetest+

硝酸还原反应(Nitratereduction一

咏酶活性(Ureaseactivity一

H2S的产生(H?Sproduction