GB/T 21771-2008 化学品 重复剂量毒性合并生殖/发育毒性筛选试验方法

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中华人民共和国国家标准

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化学品重复剂量毒性合并生殖／发育

毒性筛选试验方法

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狆狆狔犵

２００８０５１２发布２００８０９０１实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

中国国家标准化管理委员会

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前言

本标准等同采用经济合作与发展组织（ＯＥＣＤ）化学品测试指南Ｎｏ．４２２１９９６（年）《重复剂量毒性合

并生殖／发育毒性筛选试验》（英文版）。

本标准作了以下编辑性修改：

———增加了范围部分；

———计量单位改成我国法定计量单位；

———删除了ＯＥＣＤ的参考文献部分。

本标准附录、附录为规范性附录。

ＡＢ

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Ⅰ

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犗犈犆犇前言

年月，在伦敦特别召开的生殖毒性筛选方法专家会议上，讨论并达成了一项有关亚急性

１．１９９０１

毒性合并生殖／发育毒性筛选试验的方案，可有效应用于现有的化学品初步评价。

本筛选试验方案是年月在东京召开的生殖毒性筛选方法指定（委派）专家会议的成果，

２．１９９２１０

也是伦敦会议达成的草案的更新版本。本方案中生殖／发育毒性筛选部分是建立在成员国利用最初的

方法对现有大量已生产的化学品所进行的试验和针对阳性对照化学品进行探索性试验所积累的经验基

础上。亚急性毒性部分的内容与指南４０７（及现在正在更新的提案）是一致的。

３．在对化学品的毒作用特征进行评价的过程中，通常在急性经口毒性试验以后再进行亚急性经口

毒性试验，本试验可提供在一个相对有限的时间内多次给予受试样品后可能出现的健康损害效应。在

尚未批准进行９０ｄ试验时（如产量没有超过需做９０ｄ试验的标准时），本试验可提供多次给予受试样品

的基本毒作用资料，也可作为长期试验的预试验。

４．由于与生殖／发育毒性筛选试验合并进行，本试验还可初步提供受试样品对雌性和雄性动物生

殖能力（生殖腺功能、交配行为、怀孕、胎鼠和仔鼠的发育情况）可能影响的资料。本试验也可在危险度

评价的早期进行（作为化学品或有关化学品毒性的早期评价），也可对特定种类的化学品进行有针对性

的检测。本试验不能提供生殖和发育方面的全部信息。须特别指出的是，本试验对检测出生前染毒引

起的出生后表现或可能源于出生后染毒所致的可能损害作用提供有限的证据。除其他理由外，由于试

验终点具有选择性以及试验持续时间相对较短，本方法不能得出无生殖／发育毒性作用的确切结论。虽

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然获得阴性结果并不表示受试物在生殖和发育方面绝对安全，如化学品的实际暴露量远低于未观察到

有害作用的剂量（ＮＯＡＥＬ），那么阴性结果可以消除生殖／发育毒性的一些疑虑。

５．本指南特别强调将神经毒性指标也列为检测终点，也强调需要对实验动物进行非常细致的临床

观察，以便获得尽可能多的信息。本方法应识别化学品可能存在的神经毒作用，以便今后在这方面进行

深入研究。此外，本试验还可提供一些免疫毒性的基本指征。

６．在缺乏其他系统毒性、生殖／发育毒性、神经毒性和免疫毒性研究资料时，阳性结果对初步的危

害（险度）评价和作出是否必须做其他试验或进行多长时间的试验周期是有用的。阳性结果可为初步的

危险度评价提供依据，且可判断为是否需要进行其他试验或确定试验周期提供依据。试验的结果可作

为“毒性筛查数据库”（；）提供资料的组成部分之一，对评价毒性资

ＳｃｒｅｅｎｉｎＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＤａｔａＳｅｔＳＩＤＳ

ｇ

料很少或没有的现存化学品尤为有用，本试验还可用于替代亚急性毒性试验和生殖／发育毒性筛选试验

这两个独立的试验。另外，本试验还可为长期生殖／发育毒性试验选择剂量范围，或用于其他相关的

情况。

７．一般认为，怀孕与非怀孕动物对化学品的敏感性是不同的。由于本试验既观察一般系统毒性，

又观察生殖／发育毒性，因此，确定剂量水平比分别进行亚急性毒性试验和生殖／发育毒性筛选试验更复

杂。而且，由于在研究中血清生化指标测定和组织学检查不是同时进行的，因此对一般系统毒性的解释

也比独立进行的亚急性毒性试验难度大。由于存在上述技术难点，开展本试验需要具备毒性试验方面

的丰富经验。另一方面，本试验不仅可以节省动物，为区分受试样品对生殖／发育系统的直接损害和继

发于其他系统损害的间接损害，提供了较好的方法。

８．本试验比传统的２８ｄ重复染毒试验的染毒时间长，但比分别进行亚急性毒性试验和生殖／发育

毒性筛选试验节省动物。

９．本方案的染毒途径为经口给予，如采用其他染毒方式，应作适当调整。

Ⅱ

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化学品重复剂量毒性合并生殖／发育

毒性筛选试验方法

１范围

本标准规定了化学品重复剂量毒性合并生殖／生长发育毒性筛选试验的范围、术语和定义、试验基

本原则、试验方法、试验数据和报告。

本标准适用于检测化学品的重复剂量毒性及致畸性、繁殖及生长发育毒性筛选。

本标准也可以作为致畸试验、一代和两代繁殖毒性的预试验。

２术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

２．１

生殖毒性狉犲狉狅犱狌犮狋犻狅狀狋狅狓犻犮犻狋

狆狔

对后代的有害作用，和（或）损害雄性、雌性（动物）生理或生殖功能。

２．２

母体毒性犿犪狋犲狉狀犪犾狋狅狓犻犮犻狋

狔

对雌性妊娠动物直接或间接的有害作用。

２．３

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繁殖力的损害犻犿犪犻狉犿犲狀狋狅犳犳犲狉狋犻犾犻狋

狆狔

雌性或雄性动物生殖功能或能力异常。

２．４

生长发育毒性犱犲狏犲犾狅犿犲狀狋犪犾狋狅狓犻犮犻狋

狆狔

属生殖毒性，系指子代在出生前、围产期和出生以后所显现出的结构（机体缺陷）或功能异常。

２．５

剂量犱狅狊犲

所受受试物的量，常以质量（、ｍ）或动物单位体重所给予的受试物的量（ｍ／ｋ）来表示；如将受

ｇｇｇｇ

试物掺入饲料进行喂养染毒时，也可以用受试物在饲料中的恒定质量分数（ｍｇ／ｋｇ）来表示。

２．６

用量犱狅狊犪犲

犵

包括染毒剂量、染毒次数及染毒期限在内的一般性术语。

２．７

明显毒性犲狏犻犱犲狀狋狋狅狓犻犮犻狋

狔

给予受试样品后出现的明确的毒作用表现，可作为危险度评价的充分证据，预期随染毒剂量的增加

可发展为严重的中毒症状直至死亡。

２．８

未观察到有害作用的剂量狀狅狅犫狊犲狉狏犲犱犪犱狏犲狉狊犲犲犳犳犲犮狋犾犲狏犲犾犖犗犃犈犔（）

未发现与染毒有关的有害作用的最高剂量。

３试验基本原则

３．１应设多个剂量组，受试物按设计的剂量对数组雄性的雌性动物染毒，雄性动物的染毒期至少四周

１

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直至处死，包括处死的前一天，即交配前最少染毒两周，交配期和交配后期染毒约两周。由于雄性动物

交配前染毒时间相对较短，繁殖力不能作为睾丸毒性的特异性敏感指标，因此对睾丸进行详细的组织学

检查很重要。通过包括对交配前染毒两周的总共至少四周的染毒期内雄性动物的交配行为／繁殖能力

的观察，以及随后的雄性动物生殖腺的详细组织病理学检查足以检出对雄性动物繁殖力和精子形成的

主要毒性作用。

３．２雌性动物在整个试验期都应接受染毒。包括交配前染毒两周（至少包括两个完整的发情期），交配

期、妊娠期和分娩后至少４ｄ直至处死的前一天都需进行染毒。

３．３在适应期结束后，试验持续时间取决于雌性动物的毒性表现。试验期限大约为５４ｄ，即交配前至

少为，交配期为左右，妊娠期和哺乳期则分别为和左右。

１４ｄ１４ｄ２２ｄ４ｄ

３．４染毒期间，应每日密切观察动物的毒性表现。对试验期间死亡或处死的动物都应进行解剖检查。

试验结束时，全部存活动物均应处死并进行解剖检查。

４试验方法

４．１动物品系选择

本方案的受试动物为大鼠。如选用其他种属动物，应作适当修改。避免选用繁殖力低和公认生长

发育缺陷率高的品系。首选健康、刚进入性成熟期，未经交配，并且未参加过任何试验的动物。所选动

物应注明种类、品系、性别、体重和（或）周龄。试验开始时，动物的体重相差不应超过同性别平均体重的

２０％。如果本试验是某项长期试验或完整的生殖试验的预试验，应确保两个试验所选实验动物的品系

和来源的一致性。

４．２饲养条件

４．２．１动物实验室的环境温度应为２２℃±３℃，相对湿度至少应为３０％，最好不超过７０％，但清扫动

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物实验室时除外。照明方式应为人工昼夜（光照，黑暗），喂饲常规饲料，动物自由饮水。如采

１２ｈ１２ｈ

用喂饲染毒方式，为保证与受试物均匀混合，可能会影响饲料的选择。

４．２．２试验动物可单笼饲养，或按性别少量动物分笼群养（每笼不能超过只）。交配过程应在合适的５

笼具中进行。孕鼠应单笼饲养，并给予造窝垫料。

４．３动物的准备

健康初成年动物随机分成对照组和染毒组。笼具的安置方式应能尽量降低笼具放置不当对试验结

果的影响。对动物和笼具进行唯一性标记，并于试验开始前在笼中适应性喂养至少。

５ｄ

４．４样品处理

４．４．１推荐经口方式给予受试样品，如有更合适的途径，也可采用其他染毒方式。如选用经口染毒，一

般采用灌胃方式给予，也可以通过掺入饲料或饮用水的方式给予。

４．４．２可根据试验需要将受试样品溶解或混悬于适宜的赋形剂中。应尽可能选择水溶液或水混悬液，

如确实不能以水作为溶剂，再考虑选用油溶液或油乳化液（如玉米油），然后才可考虑其他可能使用的赋

形剂。当赋形剂不是水时，必须了解赋形剂的毒性及受试样品在赋形剂中的稳定性。

４．５试验程序

４．５．１动物数量和性别

各组在试验开始时每个性别至少各只动物。除非出现明显的毒性效应，期望每组至少有只孕

１０８

鼠，通常这是可接受的最低每组雌鼠妊娠数，其目的是获得足够的孕鼠和子代的资料，以正确地评价受

试样品对动物繁殖、妊娠、母鼠和仔鼠行为，以及对子代从受孕到出生后４ｄ的生长发育情况的影响。

在试验起始阶段，每个组至少应有只动物，雌雄各半。如计划对实验动物进行阶段性处死，应增加动

２０

物数以满足计划要求。受试样品最高剂量组和阴性对照组每个性别均应各设置一个由５只动物组成的

附加组，用于在试验期结束后继续对系统毒性作用的恢复、持续或迟发等情况进行至少１４ｄ的观察。

附加组的动物不进行交配，因此不用于评价生殖／发育毒性。

２

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４．５．２动物分组和剂量设计

４．５．２．１试验至少设三个染毒组和一个对照组。受试样品的剂量水平应根据其急性毒性试验或多次

染毒试验的结果来设定。如果没有适宜的一般毒性资料可供参考，应进行预试验确定剂量水平。对照

组动物除不给予受试样品外，其余的处理应与染毒组完全相同。如果受试样品使用赋形剂配制，对照组

应接受所用赋形剂的最大使用量进行平行染毒。

４．５．２．２染毒剂量水平的选择应考虑受试样品或相关物质已知的毒性和毒代动力学的数据。还应注

意怀孕和非怀孕动物对受试样品敏感性的差异。最高剂量组应可以使亲代动物出现毒性反应，但又不

引起动物死亡或明显的损害；下一个剂量水平应选择可以出现与剂量有关的反应，最低剂量组应不引起

亲代及其子代动物的任何毒性反应。组间距通常为２４倍。若设第四个剂量组，剂量组间的组距则可

～

考虑大一些，如倍。

１０

４．５．３限量试验

如果受试样品每天以１０００ｍｋ／的剂量经口给予，或经饲料／饮水给予相当的剂量，仍未观察到

ｇｇ

任何毒副作用时，则可以采用限量试验，即不必做有多个剂量组的完整试验。若根据结构相关化合物资

料预期不会产生毒性，也可采用限量试验。但当人的接触情况表明需要采用较高剂量水平时，则不能进

行限量试验。若试验采用的是其他的染毒途径：如吸入或经皮染毒，染毒的最高浓度通常可由受试样品

的理化特性来决定。

４．５．４染毒

４．５．４．１试验动物每天染毒一次，每周染毒７ｄ，受试样品一般通过灌胃给予。应使用灌胃针管或其

他合适的插管一次灌胃给予。灌胃量取决于实验动物的大小，最大的量通常不超过１ｍＬ１００／ｇ。如果

受试样品为水溶液，灌胃量则可以考虑增大到２ｍＬ１００／ｇ。在整个试验过程中，应该采用相同的灌胃

体积，通过调整受试物浓度确保各剂量组的灌胃体积相同，尽量降低灌胃体积对试验结果的影响。但由

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于具有刺激性或腐蚀性的物质在浓度较高时通常毒作用会加剧。

４．５．４．２如果将受试样品掺入饲料或溶于饮水中进行染毒，受试样品在饲料或饮水中的含量不应影响

正常的营养成分或水的平衡。饲料中受试物质量分数（ｍｇ／ｋｇ）或按体重计算的剂量水平应恒定不变，

使用其他替代方法应说明理由，灌胃染毒应在每天的相同时间进行，为使染毒剂量保持一致，应根据体

重的变化每周至少调整一次灌胃总体积。如果本试验是某项长期试验或完整的生殖试验的预试验，应

确保两次试验饲料来源一致。

４．５．５试验程序

４．５．５．１雄性和雌性动物经过至少５ｄ的适应期后进入正式试验，交配前两周开始染毒。试验日程的

安排应能保证动物在进入完全性成熟后尽快开始交配，由于不同品系大鼠的性成熟期不完全相同，因

此，针对不同品系动物选用的交配时间存在轻微差异，例如，大鼠的交配期应从周开始，而

ＳＤ１０Ｗｉｓｔ

大鼠的交配期则应从周开始。孕鼠应在分娩后第天或稍晚处死。如果采集血样需要对母鼠进

ａｒ１２４

行隔夜禁食，则不必在同一天处死母鼠和仔鼠。完成分娩过程的当天计为分娩后第天，未能成功交配

０

的雌鼠应在交配期最后一天的２４ｄ２６ｄ处死。雌、雄性动物在交配期内均继续染毒。雄性动物在交

～

配期后仍继续染毒，至少持续至整个染毒期达到２８ｄ。根据试验设计处死雄性动物，如认为合适，可保

留用于进行再一次的交配。

４．５．５．２母鼠在整个怀孕期、直至分娩后３ｄ或处死的前一天都应每天染毒。如吸入或经皮染毒，染

毒至少应持续至怀孕的第１９ｄ。

对附加组动物应持续观察，不进行交配。观察期至少持续到自第一次处死母鼠后的第天，

４．５．５．３１４

不再进行任何处理，以观察延迟出现或持续存在的毒性效应，或毒性效应的恢复情况。

４．５．５．４试验流程表见附录。

Ｂ

４．５．６交配方法

雄性和雌性动物按１∶１比例合笼交配。为避免雄性动物的偶然死亡对试验造成影响，可不采用此

３

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交配比例。雌鼠应始终与同剂量组的同一只雄鼠合笼交配直至受孕，合笼时间最长可达两周。在交配

过程中，每天早晨应对雌鼠进行检查，查看阴道中是否有精子或阴栓。将检查到精子或阴栓的当天计为

雌鼠妊娠的第天（判为交配成功动物）。若交配两周后仍未受孕，可以将不育的雌鼠与同一剂量组内

０

已被证实有生育功能的雄鼠重新配对，再次合笼交配。

４．５．７观察指标

４．５．７．１试验期间，每日至少应对动物进行一次一般临床观察，应在预期毒性症状出现的高峰期进行

观察，且应在每天同一时间点进行观察。应记录动物的健康状况。动物发病和死亡情况每天至少观察

两次。

４．５．７．２在第一次染毒前应对所有动物进行详细的检查（获得本底情况用于动物的自身前后对照），其

后每周至少检查一次，检查应在笼外一个标准的台面上进行，建议每次检查在同一时间点进行。应详细

记录检查结果，建议采用评分系统，实验室应有明确的评分标准。应尽量减少实验条件的差异对检查结

果的影响，建议由不知道动物组别的人员进行观察。观察体征应包括（但不限于）以下内容：皮肤、被毛、

眼睛和黏膜的变化，是否有分泌物或排泄物，自主运动情况（如流泪、竖毛、瞳孔大小、异常呼吸等）。还

应记录步态、姿势和对染毒操作的反应等状态的改变，是否出现阵挛、强直性动作，是否有固定动作（如

特别的梳理毛发动作、重复转圈等），是否出现难产或产程延长，是否有异常行为（例如自残、倒退行

走）等。

４．５．７．３试验过程中应从每个组中随机选择只雌性和只雄性动物进行一次功能性检查，指标包５５

括：对不同形式刺激的反应性（声音、视觉和本体感受刺激等）、抓力强度和活动度。对雄性动物的检查

应选在接近染毒结