T/GXAS 755-2024 海洋生物体 类固醇激素的测定 高效液相色谱-串联质谱法

ICS13.020

ccsz10

T/GXAS

团体标准

T/GXAS755-2024

海洋生物体类固醇激素的测定高效液

相色谱－串联质谱法

MarineOrganisms一Determinati。nofster。idh。rmones-Highperf。门nance

Iiquidchromat。graphymassspectr。metricmeth。d

2024-06-25发布2024-07-01实施

广西标准化协会发布

T/GXAS755-2024

目次

前言.................................................................................II

1范围...............................................................................1

2规范性引用文件．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1

3术语和定义.........................................................................1

4原理...............................................................................1

5干扰和消除.........................................................................1

6试剂和材料..................................................1

7仪器和设各..................................................2

8样品...............................................................................2

9分析步骤...........................................................................3

10结果计算及表示....................................................................7

11精密度和正确度．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．..................8

12质量保证和质量控制................................................................8

13废物处置..........................................................................9

14试验报告..........................................................................9

附录A（规范性〉方法检出限和测定下限................................10

附录B（规范性）精密度和正确度......................................................11

I

T/GXAS7552024

前言

本文件参照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分z标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由广西环境科学学会提出、归口并宣贯。

本文件起草单位＝广西壮族自治区海洋环境监测中心站、广西壮族自治区北海生态环境监测中心、

上海第二工业大学、广东海猝大学、广西壮族自治区钦i·M生态环境监测中心、广西蓝合创讯数据科技有

限公司。

本文件主要起草人2任朝兴、蓝文陆、高桂兰、龙慧琴、王其春、房琴、韦业、苏子幸、杨爽、

陈燕、贺亮、吴鑫、张文武、王永峰、邓元秋、黄仕英、赵辉、张际标、张鹏、赵利容、陈帅、吴茂银。

II

T/GXAS755-2024

海洋生物体类固醇激素的测定高效液相色谱－串联质谱法

警示z使用本文件的人员应有E规实验室工作的实践经验．本文件并未指出所有可能的安全问题。

使用者有责任采取适当的去全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

1范围

本文件规定了测定海洋生物体中类固醇激素的高效液相色谱－串联质谱法。

本文件适用于海洋生物体中的雄激素（诺龙、表辜酣、甲辜酣、雄烯二酣）、孕激素（孕酣、烘诺

酣、甲短孕酣、甲地孕酣〉、糖皮质激素〈可的松、氢化可的松、地塞米松〕和雌激素（雌嗣、17-a

雌二醇、17日－雌二醇、雌三醇〉等15种类固醇激素的测定，其他类固醇激素经适用性验证可参照执行。

当样品量为2.OOg，浓缩后定容体积为1.OmL，进样体积为5.0µL时，方法检出限为0.5µg/kg~1.9µg/kg,

测定下限为2.0µg/kg～7.6阳／kg，按附录A,

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单〉适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB17378.3海拌监测规范第3部分＝样品采集、贮存与运输

GB17378.6海样监测规范第6部分2生物体分析

HJ442.5近岸海域环境监视j技术规范第五部分z近岸海域生物质量监测

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

采用乙酸乙醋和甲醇溶剂萃取，超声波提取技术对海洋生物体进行前处理，用高效液相色谱一三重

四极杆质谱仪（LC-MS/MS）检测样品中的类固醇激素化合物，按多反应监测（MRM）方式，根据保留时

间和特征离子定性，内标法定量。

5干扰和消除

5.1当样品中存在基质干扰时，可通过优化色谱条件、稀释样晶、减少进样体积以及对样品进行预处

理等方式降低或消除。

5.2当样品中存在同分异构体干扰测定时，可通过改变色谱条件提高分离度或选择不同的二级质谱子

离子消除干扰。

6试剂和材料

6.1实验用水，GB/T6682，一级。

6.2乙酸乙醋（CH,COOCH,CJJ,），色谱纯。

6.3甲醇CCH,OH)，色谱纯。

6.4氨水（NH,•H20），优级纯。

6.5氨水溶液：0.03%。取0.3mL氨水（6.4）加入1000mL水中。

1

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6.6乙酸乙醋／甲醇混合溶液：1:1（体积比〉。

6.7甲酸(HCOOH):p(HCOOH)=1.22g/mL，优级纯。

6.8甲酸溶液：0.1%。取1mL甲酸（6.7）加入1000mL水中。

6.9无水硫酸续z颗粒状，优级纯。在400℃灼烧4h以上，冷却后转移至玻璃瓶中，密闭保存于干燥

器中。

6.10中性氧化铝：74阳～150µmo在400℃灼烧4h，冷却后加3%～4%水去活化，置于干燥器中保存。

6.11N－丙基乙二胶（PSA):40且m～60llmo

6.12净化粉：0.5g无水硫酸侯＋O.5g中性氧化铝＋O.2gPSAo

6.13氯化销z优级纯。在400℃灼烧4h以上，冷却后转移至玻璃瓶中，密闭保存于干燥器中。

6.14类固醇激素标准贮各液：P=100mg/L。可直接购买有证标准溶液，也可用固体标准物质制备。

用甲醇（6.3）溶解并稀释至100mg/L（参考浓度〉。贮各液在－20℃以下避光保存或参照制造商的产品

说明，并在有效期内使用。使用时应恢复至室温，并摇匀。

6.15类固醇激素标准使用液：P=1.0mg/Lo将类固醇激素标准贮各液（6.14）用甲醇（6.3）稀释至

1.0mg/L（参考浓度〉。现配现用。

6.16内标储各液：p=100皿g/L。采用阜酣d，、孕酣d，、氢化可的松1,2d＂雌三醇也内标参照。

应采用有证标准溶液或标准物质制各内标储各液，用甲醇（6.3）溶解并稀释至100mg/L（参考浓度〉。

贮各液在－20℃以下避光保存或参照制造商的产品说明，并在有效期内使用。使用时应恢复至室沮，并

摇匀。

6.17内标使用液zP=1.0mg/L。将内标储备液（6.16）用甲醇（6.3）稀释至1.0mg/L（参考浓度〉。

现配现用。

6.18针式过滤器z滤膜为0.22I.Im尼龙或聚四氟乙烯材质。

6.19氮气z纯度~99.99%。

6.20石英砂z粒径270阳～830阳。使用前应处理并检验，确认无干扰。

7仪器和设备

7.1采样瓶z旋盖广口棕色玻璃瓶，瓶盖具聚四氟乙烯内垫。

7.2高效液相色谱一三重四极杆质谱仪z配有电喷雾电离源（ESI)，具备流动相梯度洗脱和质谱多反

应监测功能。

7.3色谱柱zc＂反相高效液相色谱柱。1.7阳×50皿×2.1mm（内径〉或其他等效色谱柱。

7.4固相萃取装置z自动或手动，流速可调节。

7.5浓缩装置＝旋转蒸发装置或K-D浓缩器、氮吹浓缩仪等性能相当的设备。

7.6佛罗里土（Florisil)SPE小柱：100～200目，规格为10mL/2go

7.7微量住射器或移液枪：10此、100此、lmL、5mL。

7.8分析天平z感量0.01E和0.0001go

7.9超声波提取仪z功率不小于500W，超声波输出功率可调节。

7.10低温离心机z转速5000r/min或以上，温度范围－10℃～30℃。

7.11聚丙烯离心管，15mL,50mL，旋盖具聚四氟乙烯内垫。

7.12冷冻干燥仪。

7.13涡旋混匀器。

7.14匀浆机。

7.15一般实验室常用仪器和设备。

B样晶

2

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8.1样晶采集与保存

按照GB17378.3和盯442.5的相关规定进行生物体样品的采集。采集种类以贝类为主，根据海区（滩

涂〉特征可增选鱼类、甲壳类和藻类。样品采集后，用现场海水冲洗干净，应及时冰冻保存（－10℃～

-20℃〉。

8.2试样制备

8.2.1冷冻干燥

将生物样品解冻后，取目标部分放入匀浆机（7.14）匀化成浆后，在冷冻干燥仪（7.13）上进行冷

冻干燥。把冷冻干燥后的样品用玻璃棒轻轻捣碎，一部分用于测定含水率，一部分用于前处理。

8.2.2含水率的测定

生物体样品含水率的测定按照GB17378.6执行。

8.2.3提取

称取冷冻干燥后的样品2.Og（精确到土O.Olg），置于50皿L离心管（7.11）中，加入2mL超纯水，

在祸旋混合器（7.13）上涡旋lmin后，准确加入lOmL乙酸乙醋／甲醇混合液（6.6），涡旋lmin，置于超

声波提取仪（7.10）上超声20min，加入2.Og无水硫酸筷（6.9）和1.Og氯化纳（6.13），涡旋，快速泪

匀，置于低温离心机（7.10），以5000r/min离心5mino

8.2.4净化

转移全部上清液于另一15mL离心管（7.11）中，此离心管己装入净化粉（6.11），涡旋混合lmin,

置于低温离心机（7.10），以5000r/min离心5mino准确移取上清液5mL经过佛罗里土SPE1J、柱（7.6)

净化。

8.2.5浓缩和定容

用浓缩装置（7.5）将上述溶液浓缩至1.OmL以下，用甲醇（6.3）定容至1.OmL，加入50µL内标物

使用液（6.13），使用涡旋混匀器（7.13）混匀后用针式过滤器过滤（6.18），置于棕色进样瓶中，待

测。

8.3空白试样的制备

以石英砂（6.20）代替样品，按照与试样制各（8.2）相同操作步骤，进行实验室空白试样的制各0

9分析步骤

9.1仪器调试

9.1.1液相色谱参考条件

9.1.1.1流动相＝雄激素、孕激素和糖皮质激素流动相A甲酸溶液（6.8），流动相B甲醇（6.3);

雌激素流动相A氨水溶液（6.5），流动相B甲醇（6.3)0流动相梯度及流速按表1和表2o

表1液相色谱流动相梯度i先脱程序（雄激素、孕激素和糖皮质激素〉

时间（min)流速（ml/min)流动相A(%)流动相B(%)

。0.2955

0.50.2955

7.50.2595

11.00.2595

11.10.2955

12.50.2955

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表2液相色谱流动相梯度洗脱程序（雌激素）

时间（min)流速（mL/min)流动相A(%)流动相B(%)

。0.39010

10.39010

30.34555

40.34555

80.33070

90.3595

100.3595

10.10.39010

120.39010

9.1.1.2柱温：40"C,

9.1.1.3进样体积：5.0µL,

9.1.2质谱参考条件

9.1.2.1电喷雾离子源CESI)，雄激素、孕激素、糖皮质激素采用正离子模式，雌激素采用负离子模

式。

9.1.2.2毛细管电压：4.0kV,

9.1.2.3干燥气温度：350℃。

9.1.2.4干燥气流速：11L/min。

9.1.2.5雾化气气压：1.72×lO'Pa(25psi)

9.1.2.6多反应监测（MRM）方式，具体条件按表3,

表3目标化合物的多反应监测条件

化合物名称母离于（m/z)于离于（m/z)驻留时间（s)锥孔电压（V)碰撞能（eV)

诺龙109.1*3525

(Nondrolone)275.20.021

257.33510

雄烯工嗣96.84024

(An世。stensdione〕287.30.021

108.9*4023

雄

表率嗣96.9*3525

激(Epitestosterone]289.40.021

素