T/SDAA 0045-2021 多杀性巴氏杆菌的检测 PCR 法

主要技术内容:多杀性巴氏杆菌的检测 PCR 法 1 范围 本文件规定了猪多杀性巴氏杆菌的PCR检测方法。 本方法适用于猪多杀性巴氏杆菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期 的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括 所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T 564-2016 猪巴氏杆菌病诊断技术 3 原理 根据多杀性巴氏杆菌的基因序列设计一对特异性引物，以多杀性巴氏杆菌的 DNA 核酸 为模板，扩增特异的目的 DNA 片段。扩增的 DNA 片段经琼脂糖凝胶电泳，根据 DNA 条带 的大小来判断结果。 4 试剂或材料 除非另有规定，所用试剂均为分析纯。 4.1 水：GB/T6682，一级。 4.2 5%绵羊鲜血平板 4.3 革兰氏染液 4.4 2×Taq Master Mix 4.5 DNA Marker DL 2000 4.6 琼脂糖 4.7 TAE缓冲液 4.8 4S Green Plus 无毒核酸染料T/SDAA 0045－2021 5 仪器设备 5.1 生物安全柜：配ULPA超高效空气过滤器。 5.2 高速冷冻离心机：转速不低于12000 rpm/min。 5.3 PCR仪：最大升降温速率为4℃/秒，温度范围4℃~99℃。 5.4 凝胶成像仪：图像分辨率不低于500万像素，灵敏性可检测出低于20pg EB染色的双链 DNA。 5.5 紫外透射仪：透射紫外光源波长为 302nm。 5.6 电泳仪，恒压输出范围：3～300V、恒流输出范围：1～400mA、恒功率输出范围：1～ 120W。 6 样品 按照NY/T 541 的规定采集、贮存样品。 7 试验步骤 7.1 细菌的分离及纯培养 7.1.1 在生物安全柜内，将无菌采取的患病动物心血用接种环直接在绵羊鲜血平板上划线接 种。对采集的肺脏、肝脏或脾脏，用酒精灯火焰烧红的刀片烧烙肺脏、肝脏或脾脏的表面， 用无菌手术剪刀在烧烙部位剪开一个小口。酒精灯火焰灼烧接种环，冷却后将接种环从病料 的小口处扎入肺脏等内部，挑取少量组织，在 5%绵羊鲜血平板上划线接种。接种后的平板 贴好标签后放入恒温箱，37℃培养 24h，观察菌落大小、形态、溶血状况等。 7.1.2 猪多