GB/T 15805.1-1995 淡水鱼类检疫方法 第一部分

中华人民共和国国家标准

Gs/T15805.1一1995

淡水鱼类检疫方法第一部分

Thequarantinemethodsoffreshwaterfish-Part

1主题内容与适用范围

本标准规定了淡水鱼类传染性胰坏死病((IPN)、传染性造血器官坏死病(IHN)、病毒性出血性败血

症(VHS)、斑点叉尾鲍病毒病((CCVD)、鲤春病毒病((SVC),疖疮病、弧菌病和昏眩病的检疫方法。

本标准适用于口岸进口国外淡水鱼类的检疫，也适用于我国国内地区间同种疾病的检疫。

2设备和器械

检疫中所用设备和器械除根据各个学科有特殊要求外，均指鱼病实验室常用的设备和器械。

3传染性胰坏死病(InfectiousPancreaticNecrosis，简称IPN)

该病病原属双链RNA病毒。

本病流行于美洲、欧洲和亚洲。

主要感染对象是鱼龄6个月以内的虹缚、美洲红点蛙等蛙缚鱼类。6个月以上的鱼可以是无症状的

带病毒鱼，鱼卵也可携带病毒。

3.1临床检查

3.1.1活动情况

病鱼游动失调，常作垂直回转游动，不久便沉人底部死亡。从开始回转游动到死亡的时间为1-2h。

在有水流的饲养池中可见失去游泳能力的鱼随水流贴在排水口的拦网上。

3.1.2外部检查

病鱼体色暗黑，眼球突出，腹部膨胀。腹壁和鳍基部有出血现象。病鱼多从肛门排出线状粘液样粪

便。

3.1.3剖检

除幽门垂出血外，肝脏和脾脏显著褪色，通常消化道内无食物，胃和肠前部积有乳白色粘液而肿胀。

3.2实验室检验

3.2.1病毒分离

3.2.1.1细胞准备

a设备及器械

无菌室、超净工作台、恒温培养箱、低温冰箱(一300C)、液氮罐、赛氏漏斗和。3,0.45fm混合纤维

素酷微孔滤膜、细胞培养瓶、白色橡皮塞等。

b培养基及试剂

细胞生长液、胰酶-EDTA(乙二胺四乙酸)混合消化液、小牛血清,L一谷氨酞胺、碳酸氢钠、酒精。

细胞生长液等配制方法见附录A(补充件)。

c.接种前的细胞准备

国家技术监!局1995一12一08批准1996一07一01实施

GB/T15805.1一1995

传染性胰坏死病毒用CHSE-214,RTG-2细胞分离。CHSE-214,RTG-2最适培养温度分别为21,C

和20C。选择生长良好，形成单层的细胞培养物，倒去生长液加人适量胰酶-EDTA混合消化液消化，然

后补加生长液，按1:2或1:3的分种率将原瓶消化的细胞分装入2个或3个培养瓶中，置适温中继续

培养，当单层致密度达80%左右，即可用于病毒接种。

3.2.1-2样品接种

a.设备及器械

同3.2.1.1条a的规定，另增加冷冻离心机和1,2mL规格的移液管。

b常用的溶液

细胞维持液、磷酸缓冲盐水配〔制方法见附录A(补充件)」。

c.取样

有症状的鱼，取10尾以上样品作病毒分离用。

无症状的鱼，取60尾以上样品作病毒分离用。

对鱼卵，取60^-100粒样品作病毒分离用。

对于少量进出口成鱼，从尾动脉抽1-2mL血液，其血浆作病毒分离用，血清作抗体检测。

d.样品处理

较大的鱼取其肾、肝、脾。仔、稚鱼取鱼体全部，若是带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊。鱼卵则取全卵。

将上述待检样品称重，加磷酸缓冲盐水((PBS)匀浆，并稀释成10-'，离心30min(4000r/min)，弃

去沉淀物，将上清液通过。.45Wm微孔滤膜除菌，然后再用PBS进行10倍稀释，即成样品。

血液样品置于常温下1h后，再放在4℃下12h以上，以析出血清。然后低速离心，其沉淀作待检样

品，按上述方法制备样品液，血清作中和试验。

e.接种细胞

倒出细胞瓶中的培养液，然后接种样品液，接种量为维持液的10-',吸附1h后，加细胞维持液培

养，同时设对照。

3.2.1.3病毒培养

传染性胰坏死病病毒(IPNV)培养温度是15-20C。在培养过程中每日观察细胞变化情况，观察

7d结束。

3.2.1.4结果观察

若接种样品含有病毒，培养2^-5d后，即出现明显的细胞致病变作用((CPE)，主要特征为细胞崩

解，细胞单层破坏。收集阳性细胞悬液，冻融一次后，低速离心除去细胞碎片，上清液作病毒鉴定用。

若接种后7d仍未见CPE,则判断为阴性结果。

若7d内出现可疑CPE现象，则需将该瓶细胞培养液作为接种材料再接种一次，以判断是否有

CPEo

3.2.2病毒鉴定

3.2.2.1中和试验I(固定血清用量—稀释病毒法)

本试验用于鉴定在细胞培养中出现了CPE的样品是否为IPNV,

3.2.2.1门试验准备

。.细胞RTG-2细胞培养于96孔微量细胞培养板上。

b.病毒用标准IPNV毒株，传代后制成病毒悬液。

c.标准抗血清抗IPNV的标准血清，使用前于56℃灭活60min.

d.待检样品(出现了CPE的细胞培养物)冻融一次，除去细胞碎片后使用。

3.2.2门.2操作步骤

3.2.2.1.2.1将待检样品用Hank，液作系列稀释，使其稀释度由10二到10-a，每管含量为。.5mL.

3.2.2-1.2.2取两排试管分别从上述各稀释度的待检样品中取出0.2ml于两排试管中，然后第一

Gs/T15805门一1995

.一-一一‘-一一一叫一一一一一‘.一~一一-一

.

排管加入0.2mL抗IPNV标准血清，第二排管加入。.2mL维持液，充分混合均匀。

3.2.2.1.2.330'C温育60min,

3.2.2.1.2.4温育后分别将第一排管与第二排管的样品接种于已长满RTG-2细胞单层的96孔微量

细胞培养板，每个稀释度4孔，每孔0.1-L.

3.2.2.1.2.5将抗IPNV标准血清倍比稀释后((1:8至1:64)接种于上述培养板，每个稀释度4孔，

每孔。05mL，作为标准抗血清对照。将标准IPNV接种8孔，每孔。.05mL，作为病毒对照，其余8孔

作为正常细胞对照。

3.2.2.1.2.6各孔加入维持液至总量0.2mLe

3.2.2.1.2.了放人20'C培养箱中培养，逐日观察病变，记录结果(按表1填写)。

表1中和试验I结果记录表

待检样品一标准血清待检样品一维持液标准血清IPNV对照细胞对照

仪123456789101112

A10，

1:8

P10-1

C10-1

1:16

D10__4

E10-5

1:32

F10-c

G10?

1，64

H10-a

3.2-2.1.3结果判定

按Reed和Muench法分别计算出待检样品一标准血清与待检样品一维持液的细胞半数致死量

(TCID5o)，二者的滴度指数之差的反对数即为中和指数。若正常细胞与标准血清对照为阴性，标准毒对

照为阳性，按表2判定结果。

表2

中和指数结果判定

<10阴性(待位者不带毒)

10^50可疑

>50阳性

3.2-2.2中和试验I(固定病毒一稀释血清法)

本试验用于鉴定鱼血清中是否含有抗IPNV的中和抗体。

3.2.2.2.1试验准备

细胞RTG-2细胞培养于96孔微量细胞培养板上。

h.病毒标准IPNV，使用前用Hank。液稀释至50TCID5o/0.ImL,

血清待检血清和正常血清(阴性血清)用等量的Hanks液(每毫升含青霉素200IU,链霉素

Gs/T15805.1一1995

200mg)稀释后，于45℃灭活30min，待冷却后使用。

3.2.2.2.2操作步骤

3.2.2.2.2门将已灭活处理的待检血清，用Hanks液作系列倍比稀释，使其稀释度由1:4到l:256,

每管含量为。.2mL,

12.2.2.2.2分别在上述各管中加入。.2_ml(即为待检血清等量)的50TCID,d0.1mL的IPNV悬

液，充分摇匀混合

12.2.2.2.3于30C温育60mina

12.2.2.2.4取出后分别接种于长满RTG-2细胞单层的96孔微量细胞培养板，每个稀释度4孔，每

孔0.1ml

12.2.2.2.5按上述步骤设立正常血清对照;将标准IPNV悬液连续10倍稀释后(10-'^-10-')接种

上述培养板，每稀释度4孔，每孔。.1mL，作病毒悬液毒力滴度对照;96孔微量细胞培养板H排12孔

作为正常细胞对照。

12.2.2.2.6各孔加人细胞维持液至总量0.2mL,

3.2.2.2.2.了放入20℃培养箱培养，逐日观察病变，记录结果(按表3填写)。

表3中和试验I结果记录表

待检血清正常血清对照病毒滴度对照

仪123456789101112

A1:4

B1:810-'

C1:1610-1

D1，3210-3

E1:6410"

F1:12810-'

G1:25610-s

H细胞对照10?

3.22.2.3结果判定

根据病变用Reed-Muench法或Karber法计算出血清中抗体效价(即能保护50%的细胞培养孔不

产生病变的最高血清稀释度)。血清中和抗体效价大于或等于1!16者为阳性，小于1:16者为阴性。

3.3综合判定

若出现上述临床症状，经细胞培养又出现CPE，并经中和试验为阳性者可判定患有传染性胰

坏死病。

b.若无临床症状，但经细胞培养出现CPE，并经中和试验为阳性者判定为IPNV携带者。

若中和试验为可疑，则判定为可疑。

d·若无临床症状，经细胞培养也不出现CPE,但鱼血清中抗IPNV中和抗体为阳性者，则判定在

近期内患过传染性胰坏死病。

若仅有临床症状，或仅能在细胞培养中出现CPE，但不能被抗IPN中和抗体中和者则不能称

患有IPN，需进一步作其他病检查。

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