GB/T 45105-2024 绵羊痘和山羊痘诊断技术

ICS11.220

CCSB41

中华人民共和国国家标准

GB/T45105—2024

绵羊痘和山羊痘诊断技术

Diagnostictechniquesforsheeppoxandgoatpox

2024⁃12⁃31发布2025⁃07⁃01实施

国家市场监督管理总局

国家标准化管理委员会发布

GB/T45105—2024

目次

前言··························································································································Ⅲ

引言··························································································································Ⅳ

1范围·······················································································································1

2规范性引用文件········································································································1

3术语和定义··············································································································1

4缩略语····················································································································1

5临床诊断·················································································································1

6样品采集、保存与运输································································································2

7病毒分离与鉴定········································································································3

8组织学检查··············································································································4

9PCR检测················································································································4

10实时荧光PCR检测··································································································6

11LAMP检测············································································································7

12病毒中和试验·········································································································8

13ELISA··················································································································9

14综合判定··············································································································10

附录A（规范性）常用试剂溶液配制················································································11

附录B（规范性）PCR溶液的配制··················································································12

附录C（资料性）CaPVPCR检测结果对照·······································································15

附录D（资料性）CaPV实时荧光PCR检测结果对照··························································16

附录E（资料性）CaPVLAMP检测结果参照图·································································17

附录F（资料性）Reed⁃Muench法计算中和抗体效价···························································18

附录G（资料性）CaPV重组P32蛋白抗原的制备······························································19

附录H（资料性）阴性对照和阳性对照的制备····································································20

附录I（规范性）酶联免疫吸附试验试剂的配制··································································21

参考文献····················································································································22

Ⅰ

GB/T45105—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规

定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中华人民共和国农业农村部提出。

本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。

本文件起草单位：中国动物疫病预防控制中心、青海省动物疫病预防控制中心、大连民族大学、青

海省牦牛繁育推广服务中心、中国检验检疫科学研究院、河北农业大学、新疆维吾尔自治区动物疾病预

防控制中心、新疆生产建设兵团动物疫病预防控制中心、西藏自治区动物疫病预防控制中心、四川省动

物疫病预防控制中心、黑龙江省动物疫病预防与控制中心、江西省动物疫病预防控制中心、海南省动物

疫病预防控制中心、北京亿森宝生物科技有限公司、山东省滨州畜牧兽医研究院、西宁市动物疫病预防

控制中心、重庆市动物疫病预防控制中心、山东省动物疫病预防与控制中心、淄博市博山区畜牧渔业服

务中心、北京市动物疫病预防控制中心、陕西省动物疫病预防控制中心、哈密市动物疫病预防控制中

心、乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心、伊犁州动物疾病控制与诊断中心、广西壮族自治区动物疫病

预防控制中心、成都海关技术中心、山西省动物疫病预防控制中心、河北省动物疫病预防控制中心。

本文件主要起草人：孙雨、宋晓晖、曹际娟、李琦、翟新验、肖颖、顾小雪、王传彬、杨林、蔡金山、

景建武、阚威、袁万哲、阳爱国、李盛琼、高露、苏贵成、胡广卫、郑思思、孟茹、王淑琴、甘平、冯春燕、

赵俭波、钟映梅、张旭、杨涛、德吉玉珍、格桑央宗、种新婷、居马别克·夏拉巴依、马晓艳、杨夷平、

李庆霞、迟庆安、陈荣贵、王涛、孙航、刘颖昳、徐琦、毕一鸣、王新杰、孙晓明、高姗姗、白雪冬、徐鹏、

王金良、沈志强、曾政、骆璐、兰邹然、张月、赵浩军、李栋梁、赵光明、施开创、莫胜兰、林华、雷宇平、

许玉静。

Ⅲ

GB/T45105—2024

引言

绵羊痘和山羊痘（以下简称为羊痘）分别由绵羊痘病毒（Sheeppoxvirus，SPV）和山羊痘病毒

（Goatpoxvirus，GPV）引起。绵羊痘病毒和山羊痘病毒均属于痘病毒科（Poxviridae）、脊椎动物痘病毒

亚科（Chordopoxvirdae）、山羊痘病毒属病毒（Capripoxvirus，CaPV）。我国将其列为二类动物疫病，同

时也为世界动物卫生组织（WOAH）名录疫病。感染动物表现为发热，皮肤、黏膜、器官表面广泛性丘

疹或结节，皮肤水肿，淋巴结肿大，消瘦，产乳量大幅度降低，严重时导致死亡。山羊痘最早于公元前

200年在欧洲发现，绵羊痘最早于13世纪在英国发现，发病率50%~80%，病死率20%~80%，其中羔

羊致死率可达100%。世界各国均有羊痘发病与流行的相关报道，目前非洲北部、中东和亚洲的部分

国家流行较为严重。羊痘是阻碍引进绵羊和山羊珍贵品种以及养羊业规模化生产的主要障碍，严重危

害养羊业生产。羊痘的临床症状易与羊伪结核和羊传染性脓疱混淆，对其进行实验室鉴别诊断。

本文件参考了《陆生动物诊断试验与疫苗手册》（WOAH）的有关内容，技术方法与WOAH推荐的

标准方法一致。

Ⅳ

GB/T45105—2024

绵羊痘和山羊痘诊断技术

1范围

本文件描述了绵羊痘和山羊痘的临床诊断、病毒分离与鉴定、PCR检测、实时荧光PCR检测、

LAMP检测、病毒中和试验、ELISA等诊断方法。

本文件适用于羊痘的临床诊断、实验室检测、流行病学调查以及检验检疫。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规定性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文

件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于

本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

CaPV：山羊痘病毒属病毒（capripoxvirus）

CPE：细胞病变效应（cytopathiceffect）

Ct值：循环阈值（cyclethreshold）

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）

ELISA：酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay）

LAMP：环介导等温扩增（loop⁃mediatedisothermalamplification）

MEM：最低必需培养基（minimumessentialmedium）

OD：光密度（opticaldensity）

PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersaline）

PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

Taq：水生栖热菌（thermusaquaticus）

TCID50%tissuecultureinfectivedose

50：半数组织培养感染剂量（）

5临床诊断

5.1流行病学

5.1.1易感动物

不同品种、性别、年龄的绵羊和山羊均易感，羔羊较成年羊易感，很少感染其他家畜。

1

GB/T45105—2024

5.1.2传染源

患病羊。

5.1.3传播途径

主要经呼吸道感染，也可以通过损伤的皮肤或黏膜侵入机体。饲养管理人员，被污染的饲料、垫

料、用具、皮毛产品，体外寄生虫或昆虫等均可成为传播媒介。

5.2临床症状

5.2.1发病后体温超过40℃，2d~5d后无色素沉着的皮肤上明显可见局灶性小充血斑，接着出现丘

疹，随着病程发展，全身或腹股沟、腋下、会阴部出现直径为0.5cm~1cm的硬肿块，后期形成痘肿。

5.2.2感染动物出现大面积丘疹后，24h内可出现鼻炎、结膜炎，眼结膜和鼻黏膜上的丘疹形成溃疡，

分泌物变为黏液脓性，口腔、肛门、包皮或阴道出现黏膜坏死，所有体表淋巴结特别是肩胛前淋巴结

肿大。

5.2.3急性发病后存活的羊，出现丘疹缺血性坏死，5d~10d后结痂，结痂掉落后留有小疤痕。

5.3病理变化

5.3.1咽喉、气管、肺、胃等部位有大小、数量不等的特征性痘疹。

5.3.2肺部通常可见直径达5cm的硬块，肝脏、肾脏表面偶见直径约2cm的白斑。

5.3.3全身淋巴结肿大并有水肿。

5.3.4在真皮血管内皮细胞的胞浆里可以见到嗜酸性包涵体。

5.3.5前胃和皱胃黏膜上有形态不同的圆形或半圆形结节。

5.4结果判定

易感动物出现上述临床症状并且病理变化符合3条以上，可初步判定为疑似羊痘病毒感染。

6样品采集、保存与运输

6.1样品采集与处理

6.1.1组织样品

病羊采集皮肤丘疹，病死羊采集肺脏或淋巴结等组织，每份组织分别从三个不同的位置称取样品

约1g，加入1mL生理盐水于研磨器中研磨，离心取上清液100µL于1.5mL无菌离心管中待检。

6.1.2分泌物和排泄物样品

用棉拭子采集病羊眼、鼻等部位分泌物，或其他体表溃疡面脓液，放入含有保护液（配制方法按照

附录A中A.1）的灭菌离心管后在振荡器上充分混合，捻动、挤压干后弃去拭子。10000r/min离心

5min，吸取上清液100µL于1.5mL无菌离心管中待检。

6.1.3血清样品

静脉无菌采血。采集后的血液室温静置不少于2h，待自然凝固后，4000r/min离心10min，吸出

上层血清待检。

2

GB/T45105—2024

6.2样品运输与保存

样品采集后应冷链运输，并于24h内送达实验室。在2℃~8℃条件下保存不应超过24h，如超过

24h需冷冻保存。如无法冷链运输，应将样品置于含10%甘油的平衡盐溶液（配制方法按照A.2）中

运输。

7病毒分离与鉴定

7.1主要仪器和设备

7.1.1倒置显微镜。

7.1.2细胞计数仪。

7.1.3生物安全柜。

CO37℃±2℃

7.1.42恒温培养箱（）。

7.1.5高速冷冻离心机（最高离心速度不低于12000r/min）。

7.1.6冰箱（2℃~8℃、-20℃、-70℃）。

7.1.7微量移液器（10μL、100μL、200μL、300μL、1000μL）及配套滤芯吸咀。

7.2主要试剂和材料

7.2.1细胞培养液与细胞维持液，配制方法按照A.3。

7.2.2细胞：原代羔羊睾丸细胞（LT）和羔羊肾细胞（LK），细胞形态良好。

7.3试验步骤

7.3.1样品制备

取组织样品上清液，按1∶10的比例加入细胞培养液制备组织悬液，4℃过夜，1500r/min离心

10min，取上清液备用。

7.3.2接种

取25cm2组织培养瓶，待LT或LK细胞90%形成单层后，接种1mL处理的待检组织上清液，置

于37℃吸附1h。弃去瓶内细胞培养液，补足细胞维持液，置于37℃、5%（体积分数）CO条件下培养。

2

同时，设立正常细胞对照1瓶，对照瓶中不加入样品，弃去细胞培养液后，加入等量的细胞维持液。

7.3.3培养及观察

每日观察细胞培养物是否出现CPE，持续培养7d~14d，弃去污染的培养瓶。如果到7d仍未见

明显CPE，将细胞培养物反复冻融3次，取澄清上清继续接种LT或LK细胞，盲传3代以上，仍未出

现CPE，可判为病毒分离阴性。

7.3.4结果判定

出现CPE，可初步判为病毒分离阳性。进一步鉴定需将出现CPE的细胞培养液，用PCR检测方

法、实时荧光PCR检测方法和LAMP检测方法进行核酸检测和测序分析。

3

GB/T45105—2024

8组织学检查

8.1主要仪器和设备

8.1.1光学显微镜。

8.1.2石蜡切片机。

8.1.3捞片机。

8.1.4烘片机。

8.2主要试剂和材料

8.2.110%甲醛固定液。

8.2.2无水乙醇。

8.2.3二甲苯。

8.2.41%盐酸酒精。

8.2.5苏木素染色液。

8.2.6伊红染色液。

8.2.7树胶。

8.3样品制备

使用10%甲醛固定液对组织样品进行固定，并修成2mm左右的组织块。将修好的组织块放入

包埋盒中，经75%（体积分数）乙醇7h、85%（体积分数）乙醇3h、95%（体积分数）乙醇3h，无水乙醇

2.5h，二甲苯40min浸泡处理后，使用石蜡包埋制成石蜡块。将制作好的石蜡块切成3µm~5µm的

切片，贴在载玻片上并使用烘片机烘干。制作好的石蜡切片进行HE染色后树胶封片。

8.4显微镜观察

对组织病料切片进行光学显微镜检查，可观察到不同的特征病变。

a）急性期病变，最明显的特征是大量细胞浸润、血管炎和水肿。随着病程进行，出现更多巨噬细

胞、淋巴细胞和浆细胞浸润。

b）典型特征是在真皮层中出现数目不定的“羊痘细胞”。显微镜下观察，这些细胞较大，呈星形，

嗜酸性，胞内有不定形的胞质内包涵体和有空泡的细胞核。

8.5结果判定

当组织学样品出现上述显微镜观察变化时，可初步判定为CaPV组织学检查疑似阳性。

9PCR检测

9.1主要仪器和设备

9.1.1PCR扩增仪。

9.1.2台式高速冷冻离心机（最大离心力12000r/min以上）。

9.1.3高压灭菌锅。

9.1.4生物安全柜。

9.1.5PCR电泳仪。

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GB/T45105—2024

9.1.6凝胶成像仪。

9.1.7微量移液器（10μL、100μL、200μL、300μL、1000μL）及配套滤芯吸咀。

9.2主要试剂和材料

9.2.12×Taq