DB22/T 2051-2014 饲料中肉毒梭菌测定 PCR方法

ICS07.100.30

B20

DB22

吉林省地方标准

DB22/T2051—2014

饲料中肉毒梭菌测定PCR方法

DeterminationofClostridiumbotulinuminfeedstuffsPCRmethod

2014-02-28发布2014-04-30实施

吉林省质量技术监督局发布

DB22/T2051—2014

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。

本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。

本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华

人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国顺德出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、邵秋荣、刘斌、周亮、刘晓晖、王潇、任明月。

I

DB22/T2051—2014

饲料中肉毒梭菌测定PCR方法

1范围

本标准规定了饲料中肉毒梭菌的PCR检验方法。

本标准适用于饲料中A、B、E、F型肉毒梭菌的快速筛选检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

肉毒梭菌clostridiumbotulinum

肉毒梭菌为梭菌科梭菌属革兰氏阳性芽孢杆菌，厌氧，在适宜的培养基及特定的环境条件下产生一

类具有很强毒性的神经麻痹毒素，即肉毒毒素。

4原理

样品增菌后，培养物经DNA提取制备PCR模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物是否

有特征条带，从而对饲料中是否污染肉毒梭菌进行快速检验。

5试剂

除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA

酶污染的容器分装。

5.1引物：见表1。

1

DB22/T2051—2014

表1引物序列

扩增长度

目标菌类型引物序列

bp

上游引物：5’-GTGATACAACCAGATGGTAGTTATAG-3’

A型983

下游引物：5’-AAAAAACAAGTCCCAATTATTAACTTT-3’

上游引物：5’-GAGATGTTTGTGAATATTATGATCCAG-3’

B型492

下游引物：5’-GTTCATGCATTAATATCAAGGCTGG-3’

上游引物：5’-CCAGGCGGTTGTCAAGAATTTTAT-3’

E型410

下游引物：5’-TCAAATAAATCAGGCTCTGCTCCC-3’

上游引物：5’-GCTTCATTAAAGAACGGAAGCAGTGCT-3’

F型1137

下游引物：5’-GTGGCGCCTTTGTACCTTTTCTAGG-3’

5.2疱肉培养基：见附录A.1章。

5.3胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤（TPGY）：见附录A.2章。

5.4厌氧卵黄琼脂：见附录A.3章。

5.5细菌基因组DNA提取纯化试剂盒。

5.6TaqDNA聚合酶。

5.7dNTP：dATP（deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxyguanosina

triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dTTP

（deoxythymidinetriphosphate，脱氧胸苷三磷酸）。

5.8溶菌酶。

5.9蛋白酶K。

5.10无水乙醇。

5.11十二烷基硫酸钠（SDS）。

5.12蔗糖。

5.13三羟甲基氨基甲烷（Tris）。

5.14乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na2·2H2O）。

5.1510×PCR