T/CQAAS 006-2023 花椒品种分子身份证构建方法

主要技术内容:3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1标准样品经权威机构认定认证的代表已知品种特征特性的样品，本标准中为农作物种子，即农作物的种植材料或者繁殖材料，包括籽粒、果实和根、茎、苗、芽、叶等。3.2分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性 DNA 片段。3.3SSR 标记是一类由几个核苷酸（一般为 1～6 个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，由于基本单元重复次数的不同，形成了 SSR 长度的多态性。3.4DNA 指纹具有完全个体特异的DNA多态性，本标准中指 SSR 等分子标记扩增的多态性。3.5品种身份证指反映品种的商品属性和 DNA 指纹信息的数字和（或）字母组合。4方法4.1DNA提取采用改良的CTAB法提取花椒新鲜叶片的DNA，具体包括以下步骤：(1)在65℃水浴中预热提前配置好的2×CTAB提取缓冲液，0 .1MTris-HCl、0.02M EDTA、 1 .4M NaCl、2％PVP、2％CTAB；(2)在液氮中研磨石榴叶片至粉末状，转至2.0mL离心管中；(3)迅速加入2×CTAB提取缓冲液1 .0mL，10μlβ-巯基乙醇，混匀，65℃水浴60min，隔10- 15min颠倒摇匀一次；(4)常温下12000rpm离心5min，吸上清转移至新的2.0mL离心管中；(5)加入等体积的氯仿/异戊醇，充分混匀5min，放置5min，12000rpm常温离心10min；(6)吸上清到新的2.0mL离心管中，用氯仿/异戊醇重复抽提一次；(7)离心，吸上清到新的离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，-20℃放置2h，沉淀DNA；(8)10000rpm常温离心10min；(9)倒掉异丙醇，用500μL乙醇洗沉淀两次，吹干后用100μLTE溶解DNA；(10)加入10mg/mlRNaseA 2μL终浓度200ng/ul混匀，37℃保温2h以上；(11)加入500μLTE，再加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒摇匀2min；(12)12000rpm常温离心10min；(13)吸上清到新的离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，-20℃放置2h，沉淀DNA；(14)12000rpm常温离心10min；(15)倒掉异丙醇，用500μL乙醇清洗沉淀两次，吹干后用50μLTE溶解DNA；4℃冰箱中保存。(16)使用1.5%琼脂