DB15/T 3450-2024 SNP标记法鉴定油莎豆种质资源、品种和纯度技术规程

ICS65.020.20

CCSB05

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T3450—2024

SNP标记法鉴定油莎豆种质资源、

品种和纯度技术规程

CodeofpracticeforidentificationofCyperusesculentusgermplasm

resources,varietiesandpuritybySNPmarkermethod

2024-06-14发布2024-07-14实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T3450—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。

本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC20）归口。

本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、吉林省农业科学院（中国农业科技东北创新中心）。

本文件主要起草人：牛陆、杨向东、张立华、任伟、张原宇、侯智惠、马瑞、胡可欣、萨茹拉、路

战远、韩淑娟、武玲鑫、张宇佳、李子南、韩畅、郭茄。

I

DB15/T3450—2024

SNP标记法鉴定油莎豆种质资源、品种和纯度技术规程

1范围

本文件规定了利用单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）标记进行油莎豆种

质资源、品种及纯度鉴定的操作步骤要求。

本文件适用于油莎豆种质资源、品种及纯度的鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

SNP标记singlenucleotidepolymorphismmarker

单核苷酸多态性分子标记。

推荐引物recommendedprimer

种质资源和品种鉴定中优先选用的一套SNP引物，其检测位点多态性高，检测结果重复性好。

品种纯度varietalpurity

品种在DNA分子标记基因分型方面一致的程度，用供检样品中本品种的块茎数占供检样品块茎总数

的百分率表示。

4操作步骤

样品DNA提取

4.1.1样品准备

1

DB15/T3450—2024

试验样品块茎的分样与保存，应符合GB/T3543.2的规定。

4.1.2用于种质资源和品种鉴定样品DNA提取

从样品中随机抽取10粒块茎发苗。分单株剪取0.1g幼苗叶片用液氮研磨成粉末。将研磨粉末转入

2mL离心管，加入0.7mLCTAB提取缓冲液充分混匀。在55℃～65℃恒浴1h。加入0.7mL氯仿：异戊

醇（24:1），上下轻摇5min。10000×g，室温下离心10min。取上清液，加入上清液三分之二体积预

冷异丙醇，上下轻摇5min，-20℃冰箱放置30min。10000×g，4℃离心10min。沉淀用1mL75%的预

冷乙醇洗一次。自然干燥后，用200μL1╳TE缓冲液溶解，置4℃保存。

注：以上为推荐用于种质资源和品种鉴定的DNA提取方法，其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法都适用于

本标准。

4.1.3用于纯度鉴定样品DNA提取

按照GB/T3543.4规定的方法，从送检样品中提取不少于100粒块茎发苗。提取方法同4.1.2。

注：以上为推荐用于纯度鉴定的DNA提取方法，其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法都适用于本标准。

PCR扩增

4.2.1引物筛选

用于油莎豆种质资源、品种及纯度鉴定的73组推荐引物及其序列，按照附录A执行。

4.2.2PCR反应

PCR反应在25μL的反应体系中进行。反应体系包括：2.5μL10×PCR缓冲液，0.5μL10mmol/L

dNTPs,0.5μL5U/μLTaq酶，1.0μL50ng/μLDNA模板，1.0μL上下游引物混合物(引物浓度10

umol/L)，19.5μLddH2O。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，

72℃延伸45s，30个循环，72℃10min。反应利用96孔PCR板在PCR扩增仪上进行。

基因分型检测

采用一代测序（Sanger测序），对PCR产物进行测序，分析不同油莎豆材料SNP位点变异情况。

数据分析与判定

4.4.1数据分析

结合位点的基因型数据记录为X/X和Y/Y，其中X、Y为同一位点上两个不同的等位变异；杂合位点的

基因型数据记录为X/Y；缺失位点等位变异数据记录为-/-。油莎豆73个SNP分子标记的信息按照附录B执

行。

4.4.2种质资源和品种鉴定的判定

根据样品在73个SNP位点基因型的差异进行品种鉴定，具体判定标准如下：

——差异位点数≥3，判定为不同品种；

——差异位点数为1或2个，判定为近似品种；

——差异位点数=0，判定为极近似或相同品种。

对利用附录A中73组引物仍未检测到≥3个差异位点数的样品，必要时可增加筛选引物进行检测。

4.4.3纯度鉴定的判定

2

DB15/T3450—2024

品种纯度计算公式：品种纯度%=（供检种子粒数-非本品种种子粒数）/供检种子粒数╳100%。

3

DB15/T3450—2024

A

A

附录A

（规范性）

用于油莎豆SNP检测的73组推荐引物序列

用于油莎豆SNP检测的73组推荐引物序列见表A.1。

表A.1用于油莎豆SNP检测的73组推荐引物序列

引物名称正向引物(5'-3')反向引物(5'-3')扩增长度(bp)

CeSNP0859TTCTCGGGCTAGTGAAACTTATGCAACATGTCCCGGACTTTGCTAATA146

CeSNP1072ACTGCAGATGGGAGCATTAGAATCTGGCACCTTCACTGCTCTTGTATA259

CeSNP0414GACCTGGTTGAAGTATGTCATCCCATCATTCCACAACTGGACTTTGGT365

CeSNP0939GACCAAATCCACAAAAGCTGGTACTTGGTAGGTTGGTTGGATTATTGG378

CeSNP1035AGTCCAATTGGGAGTTTGTTGTGTCAAACTGTGAGTTGCTGGAAGAGA451

CeSNP1187AAATCAAGTGAGCAAGGCTACAGGGAACCTCAATTCACCAAAACGATC309

CeSNP0830GATCCGGTACTTTCTAGCATCCCTATCGTCCTCGTCGTAGATCAGAAC392

CeSNP0093TGAGAGAACTTTGCCTTACCTTGGTAGGGTTTACTGGTCGGGGAATAT375

CeSNP0098TGGAATCGTTCTTGACTAAGCACAATTAACATCTCGATCAGGGGTCAA479

CeSNP0243GCACAGGACCTTGTAGTTCTTCGTAGATGGTGAATTTAGATGCCGTGT437

CeSNP0432CTCCGCGAACTTTGAGAAGATCTAGGTCCAAGATGAAATTCAGTGACC438

CeSNP1018ACCATACACAACATCATTGCAAGCCCCATCAATCCATAACAGGGATAA492

CeSNP0395CTGCTGAGCTCAAGAGAAGTGATGCCATTGTTGACGGATCTAGAGCTT388

CeSNP0397TTCTTCTCGATCTCGTCCTTGACTGAAAGAACCAAGAACCAAGCTTGA474

CeSNP0541CATACCATTGCCTCATGACATCTCCACAGAGGAGGCTGAAGATGTACA384

CeSNP0014AGAAACCGCTGAGAACTGGTACACGCCTTTATCAGTAAGCAGGGAGGT176

CeSNP0081TAGAATTGTAGACAGCACCCGGTTAGAAAGAGCTCCCAGAAGCAAATT403

CeSNP0739GAGTGGGGACATTTCTCTGACACTGCCTAGGCCTAGCTGTTATGTTCA225

CeSNP0742GCCTTGGAGTTCAGTTGGGTATTAAAGGAAAACAGCCATCTGCAGTAC495

CeSNP0748ACCCAATACCATTACGCAGAAGAATATGATTAAGCCCTTCAGCTCGAG175

CeSNP0130CGTCTTCAGAAGTAGGCCAAAGAAAAATGGGTCTAGCAGAAACCACTG458

CeSNP0409CAGAGGATAAGCGCTCCTACATGTATGGATGGATGAGGAAAGAACGTA204

CeSNP0803TGGTTCAAAGATCTGTTCTTGTGGCCTTCAGCAGGAGTTAAACACCAT153

CeSNP1022TAACCCCATCCAGAGCACTGTATTAAGCACAATCATCCGACCTCTAAG196

CeSNP0037AGTCCAGCGTTTATTATGCTCAGCACTTCAATATGCGGTGAGGATTGT474

4

DB15/T3450—2024

表A.1用于油莎豆SNP检测的73组推荐引物序列（续）

引物名称正向引物(5'-3')反向引物(5'-3')扩增长度(bp)

CeSNP0038AGATCATGGCAGAGTGGCTTTTAGCAGTATTCCGGTTTTTGCATTCTC303

CeSNP0741AACCGGACTAAAATAAGGGCAGTCGAGAGCCAGAACCTTGATGTTGTT388

CeSNP0065TCAGAACAAACAAAACCCTCCCTAGGGAAGGAAAGAGTGAACAGTGAA312

CeSNP0066TCAGAACAAACAAAACCCTCCCTAGGGAAGGAAAGAGTGAACAGTGAA312

CeSNP0064TCAGAACAAACAAAACCCTCCCTAGGGAAGGAAAGAGTGAACAGTGAA312

CeSNP0609GCACTTGCATATGAATGAGTCTGCCTCCATATTGTGCCAATGTATCCA413

CeSNP0023GCATCCCACTTAGGTGTTTGGATATTTGTTCTTTACTCAGGCCTCAGG331

CeSNP0088CTGTCATCGAGGAATTCATATCCCATGAACACTACGCATTGTGCAGTT147

CeSNP0083ATTAGGGAGGAAGCCTGTCAAAAGGATTGTCGATGAGGGCTTTTAGTG343

CeSNP0407CGGGAAAACCTCTCTTCGTAATCTGACGTGATTAATGGAACAGTGCTG253

CeSNP1017CAGACCAGACAGACAGGCCTAATTAGAGTCGGTGGTCTCTCTCTCAAA499

CeSNP0965CGGAGTACGAGACTTGACAGATGAGTCATCGATGCTTAGATCTGCAGA337

CeSNP1016GCCCTCTATTATGAGAAACATCGCGTGTATTGCTGCCAACAAAGATTG443

CeSNP1015CATCTGTACCCATTTTCTCCCTTGGGAAATTGGTGCTTAGAGCTAGCA422

CeSNP1119TATGGAAGAGGAGATGCATTGACATGTAAGCTTTTGACAAACCAGCAG468

CeSNP0793AGATATCCCTGACTCGTTCACAGCGCACCAGAAAGAGAAGACGAAGAG393

CeSNP0213GCTGCTTTAACCCATCAGAAGCTACATTGTGCGAACTTATGCTCAATC108

CeSNP0092TTTCAGCTACCGTGAACGATACATATGCATGCAGAAGATGATGAGATC497

CeSNP0399TGCCAGAAACCAGAATACAGATCACCTCACAAAAGAATGCACAGTGTC361

CeSNP0192GGCAGATTCTGAGAAAAAGGATGAGGGCTCAGACGATTTCACTATGTT354

CeSNP0282CTCCGACGACGACACTACTGACTACGTCACTTGTAAAACATGTTGGGA453

CeSNP1255TGTATTGGAACTATGCCTCGTTGATGTACGCAATGCAGGTAATTGTCT460

CeSNP0180GGCGTCGTGAGTTGAAAAATCTACGGGAGACTCAATATGATCAGGCAT217

CeSNP0288GCAACATGGAAAACCATCTTTAGCGGGTAGAGAGGCCTGAGACATACA494

CeSNP1075AGGAAATGCAGCTTTGCTATGTTCTTTTGAGTTGAGGCAGAGTCCTTC472

CeSNP0352GATGGATCAAGGAACAGAAGGAGACCTATGTAGCCTTGCTTTCAGCAT483

CeSNP0575ATCATATTGTGATGGCAGCTGCTAAGGAGGAAACGTGATGACATTGTT428

CeSNP0694CCAGCATGTATTCAAACAGACGTCAACACCTCCAAGAGATCCACTCAC144

CeSNP1219TCAGTCGATAAAACAAGAGCCACAGGATGTGTCGGAGGAAAATATGAG417

CeSNP0357TCCACACTTCACTCGTGTAAACGTATGGGGAATGTATCTGCACAAAAC492

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DB15/T3450—2024

表A.1用于油莎豆SNP检测的73组推荐引物序列（续）

引物名称正向引物(5'-3')反向引物(5'-3')扩增长度(bp)

CeSNP0909AATCCAAATCTACTGCAGCGAAAGAACTGTGATTCGATCTGTCACCAA371

CeSNP1181TTTCACTTGCACCCCTAGGAATAACTAAAAGCCTAAAAGGAGCATGCA455

CeSNP0312TCTGTTGGTCCAATATAACCACGAGCCATGTAACGCTTTGTGTCTATG451

CeSNP0910AATCCAAATCTACTGCAGCGAAAGAACTGTGATTCGATCTGTCACCAA371

CeSNP0358TCCACACTTCACTCGTGTAAACGTATGGGGAATGTATCTGCACAAAAC492

CeSNP0936CTTTGTAGGAAACGCCCATTGTAGGACGACGACTTGTTCTCAGTTCAA348

CeSNP0321TCGTTAGAACATACAGGGGCTTTTTATTCCAACAATACCGCCGATTAC152

CeSNP1050AATAACCCATCCGAACCTAGCATTTAAGAAAGAGGGAGGGAGAAGGTG422

CeSNP0752GGGAGAGGATTGCTTGGAGATATTGGATCTCTAACCGTCAGTTCTCCA413

CeSNP1201ATTAGGGTTGTTGCTTGCTGGTAAATACCACCATTGGAACCATACCAG346

CeSNP0454ATCCTGAGGAATGGTTCTGACAACTGGAGGCTGATAAAAAGGGTGTAA416

CeSNP0508ACTGAAGTGCCTCCAAACACTACCAGCCAAATAGTGCTCGATCTGATC342

CeSNP1012CCTTTCTTGCACAACCCATTTATCCTCGACTGCCTTTGTTCAGAAAAT348

CeSNP0991CTCCATCCACGTCTACGAGAAACTTACCCAATCAAATGGTTGGATAGG322

CeSNP0453GGAGTTGAGGTTCTCGAAAACAGATGGAAGTGGTGAGCTATACGAACA355

CeSNP0781AAGGTTGAGAGACGTTTGAACCAGAGTGGAGAGCGCCTTTTTATAACC492

CeSNP1182TTTCACTTGCACCCCTAGGAATAACTAAAAGCCTAAAAGGAGCATGCA455

CeSNP0992CTCCATCCACGTCTACGAGAAACTTACCCAATCAAATGGTTGGATAGG322

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B

B

附录B