DB37/T 3894-2020 大白菜芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒检测技术规程

ICS65.020

B01

DB37

山东省地方标准

DB37/T3894—2020

大白菜芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒检测技

术规程

Detectionandidentificationofturnipmosaicvirusandcucumbermosaicvirusin

Chinesecabbage

2020-03-31发布2020-05-01实施

山东省市场监督管理局发布

DB37/T3894—2020

前言

本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。

本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：山东省农业科学院植物保护研究所。

本标准主要起草人：吴斌、辛相启、王升吉、姜珊珊、张眉、辛志梅。

I

DB37/T3894—2020

大白菜芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒检测技术规程

1范围

本标准规定了大白菜中芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒的间接ELISA、Dot-ELISA和普通RT-PCR检测方

法。

本标准适用于山东省芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒在传播介体蚜虫和大白菜中的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

3样品采集与保存

3.1蚜虫样品采集

在蚜虫盛发初期进行蚜虫样品采集，于白菜田、周边蔬菜田或田间杂草丛等蚜虫喜好栖息环境，采

用直径33cm的35目纱网在田间随机进行扫扑，分拣装入试剂瓶中，100%乙醇浸泡，-20℃以下冰箱保存

备用。

3.2叶片样品采集

采集表现TuMV和CMV花叶、皱缩、植株矮化、畸形等典型症状的大白菜叶片5g～10g，单株样品袋存

放。样品采集后，在冷藏条件下（2°C～8°C）运送至实验室。如果样品在2天内检测，可暂时储存于2°C～

8°C冷藏箱；如果样品在2天以后检测，保存至-80℃超低温冰箱备用，样品避免反复冻融。

4主要仪器设备、用具和试剂

4.1仪器设备

仪器设备主要有：

a)酶标仪；

b)洗板机；

c)电子天平（感量0.001g）；

d)PCR仪；

e)电泳仪；

f)水平电泳槽；

g)凝胶成像仪；

h)高速冷冻离心机；

i)水浴锅；

1

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j)样品冷藏柜；

k)低温冰箱（-20°C）；

l)超低温冰箱（-80°C）；

m)磁力搅拌器；

n)高压灭菌锅；

o)可调微量移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL）。

4.2用具

用具主要有：

a)无RNase吸头（10μL、100μL、200μL、1000μL）；

b)酶标板；

c)硝酸纤维素膜（NC膜）；

d)无RNase离心管；

e)PCR反应管；

f)研钵；

g)样品袋；

h)标签；

i)镊子。

4.3主要试剂

TuMV抗体、CMV抗体、酶标二抗、TuMV特异性引物、CMV特异性引物、Trizol、液氮、三氯甲烷、异

丙醇、乙醇、M-MLVRT反转录酶、RNA酶抑制剂、TaqDNA聚合酶、DNA分子标记、Gelred、琼脂糖等。

除特殊说明外，所有实验用试剂级别均为分析纯级。

试验用水为无菌超纯水或去离子水，均符合GB/T6682-2008。

血清学和分子生物学检测试剂配制见附录A。

5检测

5.1方法提要

芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒的血清学特性与分子生物学特性是该病毒检测方法的主要依据。两种

病毒都具有很强的免疫原性，同时都是RNA病毒，因此可利用间接ELISA、Dot-ELISA和RT-PCR方法确定

样品中是否带有上述两种病毒。

5.2间接酶联免疫吸附测定

5.2.1样品制备

将单头蚜虫置于小型离心管内，加300μL包被缓冲液研碎，4°C冰箱放置12h～16h；称取待测植株样

品0.1g以上，按1：10（质量：体积）加入包被缓冲液，用研钵研磨成浆，4°C冰箱放置4h～5h。将两类

研磨液8000r/min离心3min，上清液即为制备好的检测样品。

设阴性