DB37/T 4362-2021 流感病毒与犬瘟热病毒双重荧光RT-PCR检测方法

ICS11.220

CCSB41

37

山东省地方标准

DB37/T4362—2021

流感病毒与犬瘟热病毒双重荧光RT-PCR检

测方法

Duplexreal-timeRT-PCRdetectionmethodforinfluenzavirusandcaninedistemper

virus

2021-03-11发布2021-04-11实施

山东省市场监督管理局发布

DB37/T4362—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。

本文件由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。

本文件起草单位：山东省动物疫病预防与控制中心、中华人民共和国北京海关检科院、威海市畜牧

业发展中心、山东省畜牧总站、青岛市动物疫病预防控制中心、淄博市张店区畜牧事业服务中心、山东

农业大学。

本文件主要起草人：王贵升、张鹤晓、赵国清、尹斐斐、徐鸿、宋德武、薛瑞雪、李玉杰、杨景晁、

孙淑红、马慧玲、张华杰、兰邹然。

I

DB37/T4362—2021

流感病毒与犬瘟热病毒双重荧光RT-PCR检测方法

1范围

本文件规定了水貂、狐狸和貉流感病毒与犬瘟热病毒双重荧光RT-PCR检测方法。

本文件适用于水貂、狐狸和貉流感病毒与犬瘟热病毒的快速鉴别诊断。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应

RNA：核糖核酸

PBS：磷酸盐缓冲生理盐水

5试剂或材料

5.1除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682要求。所用液体试剂均需

使用无RNA酶的容器进行分装。

5.2TRIzol，应2℃～8℃保存。

5.30.1%DEPC水。

5.4氯仿，4℃预冷。

5.5异丙醇，4℃预冷。

5.675%乙醇，配置见A.3，应-20℃预冷。

5.7TE缓冲液，配制见A.4。

5.8阳性、阴性对照。

——阳性对照：带有流感病毒M基因和犬瘟热病毒N基因的质粒。

——阴性对照：为已知流感病毒和犬瘟热病毒阴性的动物组织悬液。

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DB37/T4362—2021

6仪器设备

6.1双通道以上荧光PCR检测仪及配套反应管（板）。

6.2高速冷冻离心机，最高转速应不低于13000r/min。

6.3冰箱，2℃～8℃和-20℃两种。

6.4微量移液器及配套吸头，量程规格应包含5μL、10μL、100μL和1000μL。

6.51.5mL离心管，应无核酸酶。

7样品

7.1采样工具

下列采样工具必须经121℃，15min高压灭菌并烘干：

——棉拭子；

——剪刀、镊子；

——1.5mL离心管；

——研钵或组织研磨仪。

7.2样品采集

7.2.1拭子样品

有咽喉拭子样品和肛门拭子样品：

a)咽喉拭子采样，采样时将拭子深入喉头来回刮3次～5次取咽喉分泌液。然后将拭子插入装有

1.0mLPBS的1.5mL离心管中，加盖、编号备用；

b)肛门拭子采样，采样时将拭子深入肛门转一圈并沾取少量粪便；然后将拭子插入装有1.0mL

PBS的1.5mL离心管中，加盖、编号备用。

7.2.2组织样品

用无菌剪刀、镊子采集不少于2.0g的肺脏等组织脏器，装入一次性自封袋或其它灭菌容器，编号

备用。

7.3样品贮运

样品采集后，放入密闭的自封袋内（一个采样点的样品，放一个自封袋），于保温箱中加冰、密封