DB51/T 2649-2019 小熊猫亲子鉴定技术规范

ICS65.020.40

B61

DB51

四川省地方标准

DB51/T2649—2019

小熊猫亲子鉴定技术规范

2019-12-17发布2020-01-01实施

四川省市场监督管理局发布

DB51/T2649—2019

目次

前言................................................................................II

1范围..............................................................................1

2规范性引用文件....................................................................1

3术语与定义........................................................................1

4样品采集与保存....................................................................1

5DNA的提取与保存...................................................................2

6微卫星标记选用....................................................................3

7实验流程..........................................................................3

8亲子鉴定数据的管理................................................................4

附录A（规范性附录）小熊猫样品采集记录表............................................5

附录B（规范性附录）小熊猫微卫星标记信息表..........................................6

I

DB51/T2649—2019

前言

本标准根据:GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》起草。

本标准附录A、附录B为规范性附录。

本标准由四川省林业和草原局提出并归口。

本标准由四川省市场监督管理局批准。

本标准起草单位：成都大熊猫繁育研究基地。

本标准主要起草人：张亮、侯蓉、张志和、沈富军、张文平、兰景超、杨旭煜、古晓东、黄祥明、

吴孔菊、李明喜、陈玲、吴里霞、杨智、罗娌、杨奎兴、卓贵富、谢军金、刘红、刘佳文、王涓、黄文

俊。

II

DB51/T2649—2019

小熊猫亲子鉴定技术规范

1范围

本标准规定了小熊猫亲子鉴定有关术语定义、DNA提取保存、亲子鉴定、个体识别的技术。

本标准适用于四川省圈养小熊猫亲子鉴定、个体识别、遗传多样性评估和遗传档案建立。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

CJJ/T263-2017动物园动物管理技术规程

3术语与定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1

微卫星标记Microsatellitemarker

基因组中的简单串联重复DNA片段。

3.2

DNA样品DNAsamples

是指利用小熊猫组织、血液或粪便提取的小熊猫基因组DNA。

3.3

微卫星个体识别MicrosatelliteIndividualidentification

采用微卫星技术进行个体识别，以确认个体身份。

3.4

微卫星亲子鉴定MicrosatellitePaternitytesting

是采用微卫星技术，根据遗传性状在子代和亲代之间的遗传规律，判断亲代和子代之间是否亲生关

系的鉴定。

3.5

微卫星分型Genotyping

是指在对样品进行微卫星位点PCR扩增后，利用测序技术测定个体基因型。

4样品采集与保存

1

DB51/T2649—2019

4.1采样范围

需鉴定的子代及其所有疑是父母。

4.2采样工具

一次性橡胶手套、EDTA抗凝采血管、采样登记表、采样箱、冰袋等。

4.3血液及组织样品采集

采集小熊猫血液样品时，佩戴一次性橡胶手套。

动物保定后，确认身份信息。采用EDTA抗凝采血管采集血液后贴上编号，并立即颠倒采血管3-5次，

放入装有冰袋的采样箱中。

小熊猫组织样品采集后分装，并在采样管上贴上编号，冷冻保存。

4.4粪便样品采集

小熊猫采样前应转移到单间或转运笼中隔离，避免粪样混淆。样品需新鲜粪便。

采集样品时，应佩戴一次性手套，禁止用手直接触碰粪便。

采集的样品装入无菌采样袋，放入装有冰袋的采样箱中。同一堆粪便尽量多取样品，以3-5团为佳。

为避免样品间的交叉污染，每次采样必须更换手套。

4.5样品记录与编号

在采集样品时，填写《小熊猫样品采集记录表》（附录A）。记录采样时间、地点、动物编号、性

别、年龄、来源以及动物体况特征等。在采血管/采样袋和采样表上同时贴上编号。

4.5.1有电子芯片标记

血液样品采集编号规则：动物园首写字母（三位）+B（血液样品）+电子芯片号，如“CDZ-B-756876521”

表示成都动物园血液样品，电子芯片号756876521。

粪便样品采集编号规则：动物园首写字母（三位）+F（粪便样品）+电子芯片号，如“CDZ-F-756345687”

表示成都动物园粪便样品，电子芯片号756345687。

4.5.2无电子芯片标记

血液样品采集编号规则为：动物园首写字母（三位）+B（血液样品）+样品号或动物呼名，如

“CDZ-B-001”表示成都动物园001号个体的血液样品，“CDZ-B-小黑”表示成都动物园小黑的血液样品。

粪便样品采集编号规则为：动物园首写字母（三位）+F（粪便样品）+样品号或动物呼名，如

“CDZ-F-001”表示成都动物园001号个体粪便样品，“CDZ-F-小黑”表示成都动物园小黑的粪便样品。

5DNA的提取与保存

样品采集后冷藏保存。血液保存温度4℃，组织和粪便保存温度-20℃。

样品采集后应尽快进行DNA提取。

5.1样品的DNA提取

使用样品对应的专用商品试剂盒或传统分子生物学技术手段进行DNA提取。

5.2DNA的保存

2

DB51/T2649—2019

近期使用的DNA，装有DNA的离心管保存于-20℃冰箱中。

长期保存的DNA，装有DNA的离心管保存于-80℃超低温冰箱中。

6微卫星标记选用

6.1亲子鉴定

进行小熊猫亲子鉴定时，在26个微卫星标记中选择使用（附录B），其中1-11号为基本标记，12-26

号为备选标记。当基本标记不能成功进行亲子鉴定时，考虑继续使用备选标记。

6.2个体识别

进行小熊猫个体识别时，在10个微卫星标记中选择使用（附录B），其中1-5号为基本标记，6-10

号为备选标记。当基本标记不能成功进行个体识别时，考虑继续使用备选标记。

7实验流程

7.1DNA质量检测

使用微量分光光度计对每个DNA样品进行浓度分析。血液样品260/280在1.8-2.0之间，粪便样品

260/280在1.7-2.1之间，浓度超过50ng/ul的DNA样品合格。不在范围内的DNA样品不合格。

质量不合格的DNA样品后续不能使用。

7.2PCR微卫星标记

7.2.1PCR引物的设计、合成与荧光标记

使用的26个微卫星标记的PCR引物序列设计参见附录B，将序列送有关生物公司合成，并进行荧光标

记。详细记录引物合成的公司名称、合成批次及每个引物标记的类型，方便后续做系统误差校正。

7.2.2PCR扩增的反应体系和扩增程序

表1PCR扩增的反应体系

用量

试剂

μL

10×PCRbuffer2.0

MgCl2(25mmol/L)1.6

dNTP(2.5mM)0.6

Taqpolymerase(2.5U/μL)0.2

引物-F（15pmol/μL）0.4

引物-R（15pmol/μL）0.4

模板DNA（20ng/μL）2.0

ddH2O12.8

3

DB51/T2649—2019

合计20

PCR扩增程序：95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，退火（退火温度根据具体的引物确定）15秒，

72℃延伸30秒（10个循环）；然后89℃变性15秒，退火（退火温度根据具体的引物确定）15秒，72℃延

伸30秒（25个循环）；最后72℃延伸10分钟。PCR产物4℃保存。

7.2.3PCR产物的质量检测

当PCR扩增完成后，取PCR产物5μL，经1.5%-2%琼脂糖凝胶电泳检测，如电泳条带清楚、片段大小

正确，表明PCR扩增成功；

将符合质量要求的PCR产物避光（使用锡箔纸盒）存放于4℃冰箱，用于基因分型；

对于不符合质量要求的样品，要对样品DNA进行纯化，并重新进行PCR扩增和质量检测；如果还是不

能满足要求，则需要重新采集动物血液或粪便样本进行检测。