GB/T 34224-2017 生物产品中功能性微生物检测

ICS07.080

中华人民共和国国家标准

GB/T34224—2017

生物产品中功能性微生物检测

Methodfordeterminationoffunctionalmicroorganisminbiologicproducts

2017-09-07发布2018-04-01实施

发布

GB/T34224—2017

■>r■—>—

刖弓

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由中国标准化研究院提出并归口。

本标准起草单位:河北省食品检验研究院、浙江T商大学、中国水产科学研究院黄海水产研究所、中

国标准化研究院、浙江李子园食品股份有限公司、河北医科大学、北京食品科学研究院、合肥T业大学、

河南大学、江南大学、河北省出入境检验检疫局、石家庄君乐宝乳业有限公司、荣成市华通海洋生物科技

有限公司。

本标准主要起草人：张岩、王彦波、傅玲琳、赵峰、马爱进、王丽霞、王顺余、吕品、周巍、孙勇、郑磊、

康文艺、周鹏、刘道亮、柴艳兵、张耀广、部晓峰、刘忠甫、李永波。

T

GB/T34224—2017

生物产品中功能性微生物检测

1范围

本标准规定了生物产品中功能性微生物检验的基本原则、一般要求和检验方法。

本标准适用于生物产品中植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus

acidophilus^、枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽抱杆菌检测(Bacilluslicheniformis^、粪肠球

菌(.Enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、产航假丝酵母｛Candidautilis)和酿酒酵

母(Saccharomycescerevisiae)的检验。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB4789.1食品安全国家标准食品微生物学检验总则

GB4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27405实验室质量控制规范食品微生物检测

RB/T151食品微生物定量检测的测量不确定度评估指南

SN/T0330出口食品微生物学检验通则

SN/T2632微生物菌种常规保藏技术规程

SN/T2660食品微生物实验室菌种保藏方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

生物产品biologicproducts

与生物有关的工业产品。

注：本标准中的生物产品特抬功能性微生物经过工业化生产扩繁后加T•制成的活菌制剂及添加了该类制剂的

产品。

3.2

功能性微生物functionalmicroorganism

一定条件下，具有确切调节改良功能的活的微生物菌株。

3.3

菌落形成单位colony-formingunits；CFU

在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落。

1

GB/T34224—2017

4总则

4.1按照本标准执行的功能性微生物检验应符合SN/T0330的规定。

4.2实验室生物安全要求应符合GB19489的规定。

4.3实验室人员应满足GB4789.1的规定。

4.4菌株保存应符合SN/T2632和SN/T2660的规定。

4.5培养基和试剂的质量要求应符合GB4789.28的规定。

4.6实验室质量控制应符合GB/T27405的规定。

4.7定量检测数值修约按“四舍五入”原则进行，报告单位为CFU/g/（CFU/mL）0定量检测的测量不

确定度评估按照RB/T151的要求执行。

4.8检验结果报告后，被检样品方能处理。样品要经过无害化处理。

5植物乳杆菌

5.1设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。

5.1.1恒温厌氧培养箱：37°C±1°C。

5.1.2冰箱：2°C〜5°C。

5.1.3天平:感量为0.1g

5.1.4均质器及无菌均质袋、均质杯。

5.1.5振荡器。

5.1.6无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

5.1.7无菌锥形瓶:容量250mL,500mL

5.1.8无菌培养皿:直径90mm

5.1.9显微镜：10倍〜100倍。

5.1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。

5.2培养基和试剂

5.2.1MRSCManRogosaSharpe）琼脂培养基：见附录A中A.l0

5.2.2MRS肉汤培养基：见A.2。

5.2.3无菌生理盐水:见A.10。

5.2.4革兰氏染色液：见A.11。

5.2.5细菌生化鉴定试剂盒。

5.3检验程序

植物乳杆菌检验程序见图1。

2

GB/T34224—2017

图1植物乳杆菌检验程序

5.4操作步骤

5.4.1样品制备

5.4.1.1固体和半固体样品

称取25g样品，置于225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min〜2min制成

1:10的样品匀液；或置于盛有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯中，8000r/min〜10000r/min均

质1min〜2min制成1:10的样品匀液。

5.4.1.2液体样品

应先将其充分摇匀后，以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内

预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10的样品匀液。

5.4.2样品稀释

5.4.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理

盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合

均匀，制成1:100的样品匀液。

5.4.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释

一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。

5.4.3培养

根据对待检样品菌含量的估计，选择2个〜3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取样品匀液

3

GB/T34224—2017

0.1mL接种于MRS琼脂平板内，使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得

接触平皿边缘。每个稀释度接种2个平板。涂布后，将平板静置10min使接种物完全被培养基吸收。

翻转平皿置于37°C±1°C厌氧培养箱中培养48h±2h0

5.4.4菌落计数

5.4.4.1选取特征菌落数在30CFU-300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于

30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两

个平板的平均数。

544.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释

度的茵落数;若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以

2,代表一个平板菌落数。

5.4.4.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

5.4.5鉴定

5.4.5.1菌落挑选和纯培养

挑选平板上5个边缘透明、整齐的菌落分别转入MRS肉汤培养基37°C±1°C厌氧培养箱中培养

24h±2h后进行形态学、生化鉴定。

5.4.5.2形态学鉴定

革兰氏染色,镜检。植物乳杆菌为革兰氏阳性杆菌，呈直杆状，长度3.0pcm〜&0“m,单个、成对或

成链状，通常缺少鞭毛，无芽抱。

545.3生化鉴定

使用细菌生化鉴定试剂盒进行生化鉴定。鉴定特征见附录B中表B.1。乳杆菌属常见菌种主要鉴

别特征参见附录C中表C.1。

5.5结果计算

5.5.1每个平板中植物乳杆菌的数量

每个平板中植物乳杆菌菌落数的计算见式（1）:

(1)

式中：

a——每块平板上的植物乳杆菌菌落数；

b——挑取后经证实为植物乳杆菌的菌落数；

A——挑取平板上用于验证的菌落数；

C——平板上的所有特征菌落数。

5.5.2菌落总数的计算方法

5.5.2.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板中植物乳杆菌菌落数的

平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（毫升）中菌落总数结果。

5.5.2.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（2）计算：

SC

N(2)

(7/1+0・172)〃

4

GB/T34224—2017

式中：

N——样品中菌落数；

工（'—-平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

—一第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

"2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

5.6报告

5.6.1结果判定

若样品菌落符合植物乳杆菌形态学及生化鉴定的特征，可判定为植物乳杆菌。

5.6.2结果报告

5.6.2.1定性报告

在25g（mL）样品中检出或未检出植物乳杆菌。

5.6.2.2定量报告

菌落数小于100CFU时，以整数报告。菌落数大于或等于100CFU时，对第3位数字进行修约

后，取前2位数字，后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示，采用两位有效数字。

6嗜酸乳杆菌

6.1设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。

6.1.1恒温厌氧培养箱：37°C±1°C。

6.1.2冰箱：2°C〜5°C。

6.1.3天平：感量为0.1g

6.1.4均质器及无菌均质袋、均质杯。

6.1.5振荡器。

6.1.6无菌吸管：1niL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

6.1.7无菌锥形瓶：容量250mL.500mL。

6.1.8无菌培养皿:直径90mm

6.1.9显微镜：10倍〜100倍。

6.1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。

6.2培养基和试剂

6.2.1MRS琼脂培养基:见A.1。

6.2.2MRS肉汤培养基：见A.2。

6.2.3无菌生理盐水:见A.10。

6.2.4革兰氏染色液：见A.11。

6.2.5细菌生化鉴定试剂盒。

5

GB/T34224—2017

6.3检验程序

嗜酸乳杆菌的检验程序见图20

图2嗜酸乳杆菌检验程序

6.4操作步骤

6.4.1样品制备

6.4.1.1固体和半固体样品

称取25g样品，置于225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min〜2min制成

1:10的样品匀液；或置于盛有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯中，8000r/min〜10000r/min均

质1min〜2min制成1:10的样品匀液。

6.4.1.2液体样品

应先将其充分摇匀后，以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内

预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10的样品匀液。

6.4.2样品稀释

6.4.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理

盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合

均匀，制成1:100的样品匀液。

6.4.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释

一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。

6

GB/T34224—2017

6.4.3培养

根据对待检样品菌含量的估计，选择2个〜3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取样品匀液

0.1mL接种于MRS琼脂平板内，使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得

接触平皿边缘。每个稀释度接种2个平板。涂布后，将平板静置10min使接种物完全被培养基吸收。

翻转平皿置于37°C+1°C厌氧培养箱中培养48h±2h。

6.4.4菌落计数

6.4.4.1选取特征菌落数在30CFU-300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于

30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两

个平板的平均数。

6.4.4.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释

度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以

2,代表一个平板菌落数。

6.4.4.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

6.4.5鉴定

6.4.5.1菌落挑选和纯培养

挑选平板上5个凸起、表面粗糙、边缘卷曲的菌落分别转入MRS肉汤培养基37°C+1°C厌氧培

养箱中培养24h±2h后进行形态学、生化鉴定。

6.4.5.2形态学鉴定

革兰氏染色,镜检。嗜酸乳杆菌为革兰氏阳性杆菌，呈杆状，两端圆，长度0.9“m〜6.0艸,单个、

成对或成链状，无鞭毛，无芽抱。

6.4.5.3生化鉴定

使用细菌生化鉴定试剂盒进行生化鉴定。鉴定特征见附录B中表B.2。乳杆菌属常见菌种主要鉴

别特征参见附录C中表C.1。

6.5结果计算

6.5.1每个平板中嗜酸乳杆菌的数量

每个平板中嗜酸乳杆菌菌落数的计算见式(3):

a=XC(3)

A

式中：

a一一每块平板上的嗜酸乳杆菌菌落数；

b一一挑取后经证实为嗜酸乳杆菌的菌落数；

A——挑取平板上用于验证的菌落数；

('一一平板上的所有特征菌落数。

6.5.2菌落总数的计算方法

6.5.2.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板中嗜酸乳杆菌菌落数的

7

GB/T34224—2017

平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（毫升）中菌落总数结果。

6.5.2.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（4）计算:

（"1+0.1"2）〃

式中：

N样品中菌落数；

sc—-平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

"2—一第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

6.6报告

6.6.1结果判定

若样品菌落符合嗜酸乳杆菌形态学及生化鉴定的特征，可判定为嗜酸乳杆菌。

6.6.2结果报告

6.6.2.1定性报告

在25g（mL）样品中检出或未检出嗜酸乳杆菌。

6.6.2.2定量报告

菌落数小于100CFU时，以整数报告。菌落数大于或等于100CFU时，对第3位数字进行修约

后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式來表示，采用两位有效数字。

7枯草芽砲杆菌

7.1设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。

7.1.1恒温培养箱：37°C±1°CO

7.1.2冰箱：2°C〜5°C。

7.1.3恒温水浴箱：80°C±1°C。

7.1.4天平:感量为0.1g。

7.1.5均质器及无菌均质袋、均质杯。

7.1.6振荡器。

7.1.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

7.1.8无菌锥形瓶：容量250mL、500mL。

7.1.9无菌培养皿:直径90mm

7.1.10显微镜：10倍〜100倍。

7.1.11pH计或pH比色管或精密pH试纸。

7.2培养基和试剂

7.2.1营养琼脂培养基：见A.3。

7.2.2营养肉汤培养基：见A.4。

8

GB/T34224—2017

7.2.3无菌生理盐水：见A.10

7.2.4革兰氏染色液：见A.11。

7.2.5细菌生化鉴定试剂盒。

7.3检验程序

枯草芽抱杆菌的检验程序见图30

图3枯草芽砲杆菌检验程序

7.4操作步骤

7.4.1样品制备

7.4.1.1固体和半固体样品

称取25g样品，置于225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min〜2min制成

1:10的样品匀液；或置于盛有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯中，8000r/min-10000r/min均

质1min〜2min制成1:10的样品匀液。

7.4.1.2液体样品

应先将其充分摇匀后，以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内

预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10的样品匀液。

7.4.2样品稀释

7.4.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理

盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合

9

GB/T34224—2017

均匀，制成1:100的样品匀液。

7.4.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释

一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。

7.4.3培养

根据对待检样品菌含量的估计，选择2个〜3个连续的适宜稀释度，每个稀释度水浴80°C±1匸维

持10min,吸取菌液0.2mL接种于营养琼脂平板内，使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂

表面,涂布棒不得接触平皿边缘。每个稀释度接种2个平板。涂布后，将平板静置10min使接种物完

全被培养基吸收。翻转平皿置于37°C±1°C培养箱中培养48h±2h。

7.4.4菌落计数

7.4.4.1选取特征菌落数在20CFU-200CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于

20CFU的平板记录具体菌落数，大于200CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两

个平板的平均数。

744.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释

度的茵落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以

2,代表一个平板菌落数。

7.4.4.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

7.4.5鉴定

7.4.5.1菌落挑选和纯培养

挑选平板上5个表面粕糙、不透明，灰色或微黄色的菌落分别转入营养肉汤培养基37°C+1匸培

养箱中培养24h±2h后进行形态学、生化鉴定。

7.4.5.2形态学鉴定

革兰氏染色,镜检。枯草芽抱杆菌为革兰氏阳性杆菌,呈杆状，长度1.5/zm~3.0“m,无荚膜，周生

鞭毛,有芽抱，芽抱椭圆形，中生或近中生，芽抱囊不明显膨大。

7.4.5.3生化鉴定

使用细菌生化鉴定试剂盒进行生化鉴定。鉴定特征见附录B中表B.3。

7.5结果计算

7.5.1每个平板中枯草芽砲杆菌的数量

每个平板中枯草芽抱杆菌菌落数的计算见式(5):

a=#XC(5)

式中：

a一一每块平板上的枯草芽抱杆菌菌落数；

b一一挑取后经证实为枯草芽抱杆菌的菌落数；

A——挑取平板上用于验证的菌落数；

C——平板上的所有特征菌落数。

10

GB/T34224—2017

7.5.2菌落总数的计算方法

7.5.2.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板中枯草芽抱杆菌菌落数

的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（毫升）中菌落总数结果。

7.5.2.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（6）计算：

+O.l"2）d

式中：

N——样品中菌落数；

sc—-平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

—-第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

"2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

7.6报告

7.6.1结果判定

若样品菌落符合枯草芽抱杆菌形态学及生化鉴定的特征，可判定为枯草芽抱杆菌。

7.6.2结果报告

7.6.2.1定性报告

在25g（mL）样品中检出或未检出枯草芽抱杆菌。

7.6.2.2定量报告

菌落数小于100CFU时，以整数报告。菌落数大于或等于100CFU时，对第3位数字进行修约

后，取前2位数字，后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示，采用两位有效数字。

8地衣芽砲杆菌

设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。

8.1.1恒温培养箱：37°C±1°CO

&1.2冰箱：2°C〜5°C„

&1.3恒温水浴箱：80°C±1°C。

&1.4天平：感量为0.1g。

&1.5均质器及无菌均质袋、均质杯。

&1.6振荡器。

&1.7无菌吸管：1niL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

61.8无菌锥形瓶：容量250mL.500mL。

61.9无菌培养皿:直径90mm

61.10显微镜：10倍〜100倍。

61.11pH计或pH比色管或精密pH试纸。

11

GB/T34224—2017

&2培养基和试剂

&2.1营养琼脂培养基：见A.3。

&2.2营养肉汤培养基：见A.4。

&2.3无菌生理盐水:见A.10。

&2.4革兰氏染色液：见A.11。

&2.5细菌生化鉴定试剂盒。

&3检验程序

地衣芽抱杆菌的检验程序见图40

图4地衣芽砲杆菌检验程序

&4操作步骤

&4.1样品制备

&4.1.1固体和半固体样品

称取25g样品，置于225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min〜2min制成

1:10的样品匀液；或置于盛有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯中，8000r/min〜10000r/min均

质1min〜2min制成1:10的样品匀液。

&4.1.2液体样品

应先将其充分摇匀后，以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内

预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10的样品匀液。

12

GB/T34224—2017

&4.2样品稀释

&4.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理

盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合

均匀，制成1:100的样品匀液。

&4.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释

一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。

&4.3培养

根据对待检样品菌含量的估计，选择2个〜3个连续的适宜稀释度，每个稀释度水浴80°C±1£维

持10min,吸取菌液0.2mL接种于营养琼脂平板内，使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂

表面,涂布棒不得接触平皿边缘。每个稀释度接种2个平板。涂布后，将平板静置10min使接种物完

全被培养基吸收。翻转平皿置于37°C±1°C培养箱中培养48h±2h。

&4.4菌落计数

&4.4.1选取特征菌落数在20CFU-200CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于

20CFU的平板记录具体菌落数，大于200CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两

个平板的平均数。

&4.4.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释

度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以

2,代表一个平板菌落数。

&4.4.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

&4.5鉴定

&4.5.1菌落挑选和纯培养

挑选平板上5个白色不透明、湿润、边缘光滑的菌落分别转入营养肉汤培养基37°C±1°C培养箱

中培养24h±2h后进行形态学、生化鉴定。

&4.5.2形态学