DB13/T 2609-2017 禽流感病毒与新城疫病毒二重RT-PCR检测方法

ICS65.020.30

B41

DB13

河北省地方标准

DB13/T2609—2017

禽流感病毒与新城疫病毒二重RT-PCR

检测方法

2017-11-22发布2017-12-22实施

河北省质量技术监督局发布

DB13/T2609—2017

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由河北农业大学提出。

本标准起草单位：河北农业大学。

本标准主要起草人：袁万哲、刘聚祥、陈立功、孙继国、董世山、武现军、刘静、张磊、李睿文、

李丽敏、白云、韩庆安。

I

DB13/T2609—2017

禽流感病毒与新城疫病毒二重RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了禽流感病毒与新城疫病毒RT-PCR检测方法的技术要求。

本标准适用于检测家禽咽喉拭子、肛拭子，发病禽组织和这些采集样品培养物中的禽流感病毒与

新城疫病毒。

2缩略语

下列缩略语适用于本文件。

EB：溴化乙锭（ethidiumbromide）

DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate）

PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）

RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（reverse-transcriptionpolymerasechainreaction）

dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）

3试剂或材料

包括LSTRIzolRNA提取试剂或各种市售病毒核酸提取试剂盒，氯仿，异丙醇，75%乙醇，1.0％琼

脂糖凝胶，50×TAE缓冲液，溴化乙锭（EB，10ug/μL）或核酸染料，焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的

灭菌的双蒸水，DNA分子量标准（100bp），2×TaqMasterMix。

警示:氯仿属中等毒性，在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应

立即冲洗；电泳中用到的EB在操作中应戴手套和口罩。试验中被EB污染的物品要进行无害化处理；DEPC

在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。

3.1LSTRIzolRNA提取试剂或病毒核酸提取试剂盒。

3.2氯仿:又名三氯甲烷。

3.31.0％琼脂糖凝胶，配制方法见附录A中A.1。

3.450×TAE缓冲液，配制方法见附录A中A.2。

3.5溴化乙锭（EB，10ug/μL）或核酸染料，配制方法见附录A中A.3。

3.6焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌的双蒸水，配制方法见附录A中A.4。

3.7DNA分子量标准（100bp）:包含100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp几种分

子量标准。

3.8反转录酶:M-MLV反转录酶（200U/μL）或AMV反转录酶（10U/μL）。

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DB13/T2609—2017

3.9RNA酶抑制剂。

3.102×TaqMasterMix:含有PCR缓冲液、酶混合物、dNTP混合物、无RNA酶的水等。

3.11dNTP。浓度为2.5mM。

3.12引物:反转录引物、上游引物与下游引物见附录B中的表B.1。引物浓度为10μmol/L。

4仪器设备

4.1PCR仪:温度范围4.0℃～99.9℃,样品基座配置至少包括单个0.2mL孔。

4.2凝胶成像系统:检测灵敏度DNA≥0.1ng；有效像数1360×1024、10bit、USB2.0。

4.3台式低温高速离心机:最