GB/T 18090-2000 猪繁殖和呼吸综合症诊断方法

GB/'r18090-2000

前言

猪繁殖和呼吸综合症(简称PRRS)是由PRRS病毒引起的一种接触传染性疾病。各种年龄的猪均

易感染。妊娠母猪感染后可引起流产、死胎、木乃伊胎及弱胎，仔猪可发生呼吸障碍和高病死率，其他猪

常呈隐性感染或仅出现轻度的呼吸道症状。PRRS病毒有欧洲型和美洲型两种主要抗原型，分别以IN

和VR-2332为代表株，型间具有明显的抗原交叉反应性。据现有资料，我国流行的毒株为美洲型本病

几乎发生于世界各养猪国家，并于九十年代中期传入我国。由于其对养猪业的严重威胁性，国际兽疫局

(1996)已将本病列为B类传染病。

大连动植物检疫局在国内率先开展了PRRS的研究工作，建立了具有与国际同等水平的病毒分离

鉴定、间接免疫荧光试验和血清中和试验等诊断方法。其他单位也相继建立了多种酶联免疫吸附试验

等

本标准是在综合我国科研成果的基础上，参照国际兽疫局(OIE)编写的《哺乳动物、禽和蜜蜂A和

B类疾病诊断试验和疫苗标准手册》(第三版，1996)编写的。其技术内容与OIE所推荐的基本一致。

本标准的附录A、附录B和附录C都是标准的附录。

本标准由农业部提出。

本标准起草单位:中华人民共和国大连动植物检疫局。

本标准起草人:孙颖杰、苏永生、潘凤城、孙延峰、简中友。

中华人民共和国国家标准

猪繁殖和呼吸综合症诊断方法GB/T18090-2000

Diagnosticmethodsofporcinereproductive

andrespiratorysyndrome

1范围

本标准规定了猪繁殖和呼吸综合症((PRRS)的诊断方法。

本标准适用于猪繁殖和呼吸综合症的诊断。

2诊断方法的种类和选用

PRRS的诊断方法有多种。依据临床症状和病理变化只可作出初步诊断，确诊必须依靠实验室检

查。目前已建立和应用的实验室诊断技术有病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验UPMA)、间

接免疫荧光试验(IFA)、间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)和血清中和试验(SN)等。病毒的分离与

鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定。其余4种方法主要用于检测PRRS病毒抗体IPMA,IFA

和间接ELISA三者特异性相似，但以间接ELISA的敏感性最高。应用这三种方法一般不易区别病毒的

抗原类型，故多适用于确定病性。SN反应具有明显的抗原型别差异，因此，它既适用于确定病性，也适

用于鉴定病毒的抗原类型。中和抗体出现最晚，不适合于早期诊断

本标准指定上述五种实验室诊断技术为我国进出境和国内生猪PRRS的诊断方法，保证了我国对

PRRS的诊断与国外的一致性。在实际应用时，可根据需要和条件，从中选用1.2种方法即可。

3病毒的分离与鉴定

3门材料准备

3.1.1器材:96孔细胞培养板、微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳(COQ)恒温箱、普通冰箱及低温冰

箱、离心机及离心管、组织研磨器、孔径。.2hem的微孔滤膜、普通光学显微镜。

3.1.2试剂:RPM11640营养液、犊牛血清、青霉素(10"IU/ml)与链霉素(100pg/mL)溶液,7.5%碳

酸氢钠溶液等。

3.1.3细胞培养物:猪原代肺泡巨噬细胞培养物((PAM)或MARC-145或HS2H细胞。PAM由无

PRRS猪获取，并经批次检验合格，制备和检验方法见附录B.MARC-145或HS2H细胞由国家指定单

位提供

3门.4样品

3.1.4.1样品的采取和送检:在发病早期，无菌地采取病猪的血清或腹水对病死猪(如流产的死胎)和

扑杀猪(如弱胎猪)，应立即采取肺、扁桃体和脾等组织数小块，置冰瓶内立即送检。不能立即检查者，应

放一25C一一30'C冰箱中，或加50%甘油生理盐水,4℃保存送检

3.1.4.2样品的处理:血清和腹水可直接使用。肺、脾和扁桃体等组织可单独使用，也可混合后使用。各

组织剪碎后研磨成糊状，加入RPM11640营养液，制成10%悬液，3000Xg离心15min，吸取上清液，加

入青霉素500IU/ml、链霉素500vg/ml、庆大霉素500pg/ml和两性霉素B200pg/m1。怀疑有细菌

国家质t技术监督局2000一04一26批准2000一10一01实施

GB/"r18090-2000

污染的样品，也可用0.2pm微孔滤膜过滤处理

3.2操作方法

3.2，稀释样品:取96孔细胞培养板每孔加入细胞培养液RPM11640含犊牛血清lo0o,青霉素

100IU/mI、链霉素100pg/mL、庆大霉素50pg/mI、两性霉素B10pg/mL,pH=7.2)90p.L，在Al和

C1孔内加人同一份已处理的样品各10pL(样品lox稀释)。将板轻轻摇动后，从Al和C1排孔各取10

[LL分别移入BI和Dl排孔内(样品loox稀释)。除第6和第12列留作正常细胞对照外，其他各孔的样

品稀释方法同上。振动稀释板后加盖，置4'C冰箱内保存备用。

3.2.2制备细胞板:已建立的某些猴肾细胞系不能支持所有分离物特别是欧洲型病毒株的良好生长，

因此病毒分离应首选PAM细胞，先将PAM细胞泥用细胞培养液RPM11640稀释，使细胞终浓度为

1X10`细胞/mL。或将MARC-145或HS,H细胞用MEM细胞营养液稀释，细胞终浓度为5X10细‘胞/

ml。然后，在另一块96孔细胞培养板上每孔加入上述细胞悬液100VL,

按照土述操作，每板可检测20份样品，每份样品重复2个滴度第6和第12列留作正常细胞对照

(不接种样品)

3.2-3接种样品:由样品稀释板每孔内各吸取稀释的样品液50pL，接种于已形成细胞单层的细胞板

相应的孔内(第一代)。细胞板加盖后，放入370C5%二氧化碳保湿恒温箱中培养，每天观察致细胞病变

作用(CPE)，连续观察2d-5d,CPE通常在接种后1d--4d内出现，主要呈现细胞圆缩、聚集、固缩，最

后溶解脱落

3.2.4培养物盲传:根据第一代培养物CPE出现的情况(通常在接种后的第2d--3d)安排盲传。盲传

时，不论CPE有无，一律各取孔内混悬液25PL，移入新细胞板相应的孔内。再于370C5环二氧化碳保湿

恒温箱中培养2d-5d，每夭观察CPE.

13结果的判断和解释

在第二代培养结束时，不论是否出现CPE，对所有的孔必须采用免疫过氧化物酶单层试验QPMA)

或间接免疫荧光试验QFA)进行终判;只要对PRRS病毒阳性血清呈现阳性反应，则被认定为PRRS病

毒分离阳性。

4免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)

41材料准备

4门门器材微量移液器、倒置显微镜等。

4-1.2试剂

4.1-2.1IPMA诊断板的制备:见附录Bo

4.1.2.2标准阳性血清、标准阴性血清和兔抗猪过氧化物酶结合物均由国家指定单位提供。使用前按

说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度

4.1.2.3洗涤液、血清稀释液和显色/底物溶液依照附录A自行配制

4.1.3样品:采集被检猪血液分离血清，血清必须新鲜透明不溶血无污染，密装于灭菌小瓶内，4'C或

一30C冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用血清稀释液作20倍稀释

4.2操作方法

参照图I

GB/T18090--2000

A庆门厂歹压，}ss}玉翻「一]巨口巨二「巨二

ss巨一

B下【门厂P1巨井1飞三压刃巨]巨习巨口二〔巨二巨一

CS7

吓门巨二〔二厂二〔二巨〕巨二巨][卫巨二l一

D

I"【二「二巨口

压]二区二巨二〔二二〔〔二巨;巨口〔二

E巨石]仁二〔二仁口二【]口〔巨口〔口巨二巨]

FS2S2巨二匡]二〔巨二巨习

匡习区二二【一巨二巨二匡{

G3巨]匕二三〔仁二巨二巨卫

匹刃巨夏]匡三〔二二〔巨卫

HL二二〔一巨口〔二匕仁二仁二

巨5S5一匹至〔二仁‘

V,V'wV'V'wV'V'VV'V,V

V--感染PRRS病毒的细胞列戊一未感染PRRS病毒的细胞列;C一空白对照孔出一标准阳性血清对照孔;

N一标准阴性血清对照孔;S1,S2,S3等一被检血清编号

图1IPMA和IFA诊断板加样示意图

4.2.1取已作20倍稀释的被检血清加入IPMA诊断板同一排相邻的2个病毒感染细胞孔(V')及其

后的1个未感染细胞孔(V-)内(参照图1)，每孔50PL，同时设立标准阳性血清、标准阴性血清和空白

对照，以血清稀释液代替血清设立空白对照.封板并于4℃条件下过夜。

4.2.2弃去板中液体，用洗涤液洗板3次，每孔100pL，每次1min-3min，最后在吸水纸上轻轻拍

干。

4.2.3每孔加人工作浓度的兔抗猪过氧化物酶结合物50pL，封板后放在保湿盒内于37`C恒温箱中感

作60min.

4.2.4弃去板中液体，洗涤三次，方法同4.2.2,

4.2-5每孔加入显色/底物溶液50IL，封板于室温((18'C-24C)下感作30min,

4.2.6弃去板中液体，洗涤1次，方法同4.2.2，再用三馏水洗涤2次，最后在吸水纸上轻轻拍干，待

检。

4.3结果判定与解释

将IPMA诊断板置于倒置显微镜下判读。在对照标本都成立的前提下，即空白对照感染细胞孔

(P"V,)和未感染细胞孔((P"V-)均应为阴性反应;标准阳性血清对照感染细胞孔((P"V`)应呈典型

阳性反应，未感染细胞孔((P·V-)应为阴性反应;标准阴性血清对照感染细胞孔(N·V`)和未感染细

胞孔(N"V-)均应呈阴性反应;被检血清未感染细胞孔(V-)不应出现阳性反应。被检血清标本的细胞

浆(可能仅见于部分细胞)出现弥漫状或团块状棕红色着染者，判读为免疫过氧化物酶单层试验阳性，记

作IPMA(+);无棕红色着染者，判读为免疫过氧化物酶单层试验阴性，记作IPMA(一)。IPMA(+)者

表明被检猪的血清中含有PRRS病毒的抗体。

5间接免疫荧光试验(IFA)

5.1材料准备

5门门器材:荧光显微镜、恒温箱、保湿盒、微量移液器等

5.1.2试剂

5.1-2.1IFA诊断板的制备:见附录B.

5.1.2.2兔抗猪异硫氰酸荧光黄(FITC)结合物、标准阳性血清和标准阴性血清，由国家指定单位提

供

5.1.3样品:采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内,4C

或一30〔冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用PBS液作2。倍稀释

5.2操作方法