GB/T 14926.43-2001 实验动物 细菌学检测 染色法、培养基和试剂

ICS65020.30

I344词臀

中华人民共和国国家标准

GB/T14926.43-2001

实验动物细菌学检测

染色法、培养基和试剂

Laboratoryanimal-Bacterioogicalmonitoring-

Staining,mediaandreagents

2001-08-29发布2002-05-01实施

中华人民共和匡

国家质量监督检验检疫总婿

GB/T14926.43-2001

前言

本标准规定了实验动物微生物学检测的染色法、培养基和试剂。在以前的相关标准中对染色法、培

养基和试剂的具体内容没有进行描述，基本上是引用GB4789.4-1994《食品卫生微生物学检验沙门

氏菌检验)),GB4789.10一工994((食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验)),GB4789.工工-1994

食《品卫生微生物学检验溶血性链球菌检验》和GB4789.28-1994《食品卫生微生物学检验染色

法、培养基和试剂》中相关内容，给本标准的使用造成不便。为将染色法、培养基和试剂的配制方法和操

作程序标准化并便于查找，特制定本标准。

本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。

本标准起草单位:中国实验动物学会。

本标准主要起草人:李红、黄韧、范薇。

中华人民共和国国家标准

实验动物细菌学检测

染色法、培养基和试剂

GB/T14926.43-2001

Laboratoryanimal-Bacteriologicalmonitoring

-Staining,mediaandreagents

范围

本标准规定了各种染色法、培养基和试剂。

本标准适用于小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、犬、猴的细菌学检测。

2原理

实验动物微生物从培养基中摄取营养物质，维持正常的生长繁殖和代谢，其所含细胞物质能与各种

染料结合，呈现不同颜色。

3染色液的配制和染色法

3.1革兰染色法

3.1.1结晶紫染色液

结晶紫1g

95%乙醇20mL

1%草酸钱水溶液80mL

将结晶紫在乳钵内研磨，用乙醇溶解，加人草酸按水溶液混合，即可使用。

3.1.2碘液

碘1g

碘化钾29

蒸馏水300mL

将碘化钾与碘先用少量水溶解，待全部溶解后，加蒸馏水至300mL,

3.1.3脱色液

95%乙醇

3.1.4沙黄(番红)复染液

沙黄0.25g

95%乙醇10mL

蒸馏水90mL

将沙黄在乳钵内研磨.用乙醇溶解，加人蒸馏水混合，即可使用。

3.1.5染色法

3.1.5.1涂片风干后在火焰上固定。

3.1.5.2滴加结晶紫染色液，染色1min，流水冲洗，甩干。

中华人民共和国国家质tI监督检验检疫总局2001-08-29批准2002-05-01实施

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GB/T14926.43-2001

3.1.5.3滴加碘液，媒染1min，流水冲洗，甩干。

3.1.5.4滴加95%乙醇脱色约15^30s，流水冲洗，甩干。

3.1.5.5滴加沙黄复红染液，染色1min，流水冲洗，甩干，风干或滤纸吸干后镜检。

3.1.6结果

使用油镜放大1000倍观察，革兰阳性菌呈蓝紫色，革兰阴性菌呈红色。

3.2姬姆萨染色法

3.2.1姬姆萨染液

3.2.1.1储存液

姬姆萨粉末。.59

甘油(中性)25mL

甲醇25mL

将姬姆萨粉于研钵内，先加少许甘油研磨，至甘油加完为止，倒人棕色试剂瓶中，再用少量甲醇加人

研钵内，逐渐将甘油洗下，倒人试剂瓶内，直至用甲醇洗净研钵体内甘油为止。并将剩余甲醇一并加人

瓶中，塞紧瓶盖，充分摇匀，置600C温箱内24h或室温一周后即可使用。

3.2.1.2应用液

使用前储存液用pH7.2-7.4PBS10倍稀释即成。

3.2.2染色法

涂片或压印片风干后用甲醇固定5min后滴加姬姆萨应用液，染色20-30min，用流水冲洗，甩干，

风干或滤纸吸干后镜检。

3.2.3结果

使用油镜放大1000倍观察，组织、脓汁或红细胞呈红色，细菌呈紫色。

3.3英膜染色法

3.3.1染色液

甲醛中加人2%印度黑汁;

革兰染色液中的沙黄复染液。

3.3.2染色法

3.3.2.1取一接种环肉汤培养物于载玻片上，再取一接种环甲醛印度黑汁与其混匀，推成薄片，自然干

燥后火焰固定。

3.3.2.2滴加沙黄复染液，染色30s，吸去多余液体，干燥后油镜观察。

3.3.3结果使用油镜放大1000倍观察，细菌周围有透明带者为英膜染色阳性。

3.4支原体菌落染色法

3.4.1染色液(Dienes染色液)

美兰2.59

刃天青(azure)1.25g

麦芽糖10.0g

苯甲酸。.29

蒸馏水100mL

3.4.2染色方法

临用前将染色液用蒸馏水稀释100^-300倍，滴加到疑似有支原体菌落的平皿中，使其铺满个平皿，

不断摇动，15min后倒掉染色液，用pH7.4PBS洗3次。

3.4.3结果

平皿置解剖镜或低倍镜下观察，支原体菌落呈蓝色，L型细菌菌落在短时间内能染上蓝色，但30-

60min后褪色，呈无色。

GB/T14926.43-2001

3.5乳酸酚棉蓝染色液

3.5.1染色液

结晶酚20g

乳酸20mL

甘油40mL

蒸馏水20mL

棉蓝0.05g

除棉蓝外，其余成分混匀后水浴加热，充分搅拌直至完全溶解，然后加人棉蓝，混合均匀，必要时过

滤，瓶装备用

3.5.2染色方法:取载玻片并加染色液数滴，用接种针(环)取培养物置于染色液中，然后加盖玻片，静

置10min后，吸去周围染液，用高倍镜检查。

3.5.3结果:真菌菌体呈蓝色。

3.6鞭毛染色液

3.6.1染色液

3.6.1.1甲液:单宁酸5g,氯化高铁((FeCl,)1.5g溶于100mL蒸馏水中，待溶解后加人1%的氢氧化

钠溶液1mL和15%的甲醛溶液2mL.

3.6.1.2乙液:2g硝酸银溶于100mL蒸馏水中。

在90mL乙液中滴加浓氢氧化按溶液，到出现沉淀后，再滴加使其变为澄清，然后用其余10mL乙

液小心滴加至澄清液中，至出现轻微雾状为止，(此为关键性操作，应特别小心)，滴加氢氧化按和用剩余

乙液回滴时，要边滴边充分摇荡，染液当天配，当天使用。

3.6.2染色法:在风干的载玻片上滴加甲液4-6mL后，用蒸馏水轻轻冲净。再加乙液，缓缓加热至

冒气，维持约30s(加热时注意勿使出现干燥面)，在菌体多的部位可呈深褐色到黑色，停止加热，用水冲

净，烘干镜检。

3.6.3结果:用油镜放大1000倍观察，菌体及鞭毛呈深褐色或黑色。

3.7氢氧化钾二甲基亚矾液

3.7.1成分

二甲基亚矾(DMSO)40mL

氢氧化钾10--20g

蒸馏水60mL

3.7.2制法:将DMSO与蒸馏水混匀后加人氢氧化钾，置棕色瓶中备用。

4一般培养基、选择性培养基和鉴定用培养基

4.1牛肉浸液培养基

4.1.1成分

新鲜除脂牛肉500g

氯化钠5g

蛋白陈10g

蒸馏水1000mL

pH7.4一7.6

4.1.2制法

将完全除去脂肪、肌腔和筋膜的牛肉500g，加蒸馏水1000mL，充分搅拌后置4℃冰箱过夜。次日

煮沸30min，并不时搅拌。用绒布或多层纱布粗过滤，再用脱脂棉过滤即成。在滤液中加人其他成分

溶解后用氢氧化钠溶液矫正pH至8.0，并煮沸10min，补充蒸馏水至1000mL>pH有明显下降时再矫

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GB/T14926.43-2001

正至7.6-7.8，最后用滤纸过滤，呈清晰透明、淡黄色液体，121C‘灭菌15min备用，此时的pH值应该

是7.4--7.6.

4.2营养肉汤

4.2.1成分

蛋白陈10g

牛肉膏39

氯化钠59

蒸馏水1000mL

pH7.4

4.2.2制法

将上述成分称量混合溶解于水中，校正pH至7.4，分装中试管，每管5mL,121℃灭菌15min,置

4℃冰箱保存，两周内用完。

4.3普通营养琼脂

4.3.1成分

营养肉汤中加人1.2%-1.5%的琼脂。

4.32制法

煮沸溶解琼脂后121℃灭菌15min.待冷至50℃左右时倾注无菌平皿，凝固后置4'C冰箱保存，两

周内用完。

4.4血琼脂

4.4.1成分

营养琼脂中加人5%-10%的脱纤维羊血。

4.4.2制法

待已灭菌的营养琼脂冷至50℃左右时以无菌手续加人血液，轻轻摇匀后倾注平皿，凝固后置4℃冰

箱保存，一周内用完。

4.5半固体琼脂

4.5.1成分

营养肉汤中加人。3%的琼脂。

4.5.2制法

加热煮沸，待琼脂溶化后分装小试管，每管2mL.塞上透气塞，121℃灭菌15min，直立放置，冷却后

4℃冰箱保存，两周内用完。

4.6DHL琼脂(胆盐硫乳琼脂培养基)

4.6.1成分

蛋白陈209

牛肉膏39

乳糖10g

蔗糖10g

去氧胆酸钠19

硫代硫酸钠2.39

构椽酸钠19

水解酪蛋白59

构椽酸铁馁19

1肠中性红3mL

琼脂粉159

GB/T14926.43-2001

蒸馏水1000mL

pH7.4

4.6.2制法

除1%中性红溶液及琼脂外，上述成分混和，微温使溶解，调节pH值至7.4，加人琼脂，加热煮沸溶

化后再加人中性红溶液，摇匀，冷至约50^-55℃时倾注平皿。凝固后放置4℃冰箱保存，两周内用完。

4.7SS琼脂

4.7.1成分

蛋白脉5g

牛肉膏5g

乳糖10g

胆盐(3号)3.5g

构椽酸钠(H2O)8.5g

硫代硫酸钠8.5g

构穆酸铁按1g

1洲中性红溶液2.5mL

。1%亮绿溶液。.33mL

琼脂5--20g

蒸馏水1000mL

pH7.0一7.2

4.7.2制法

除中性红、亮绿及琼脂外，混和其他成分，加热溶解，调节pH值，加人琼脂，加热溶化，再加人中性

红和亮绿摇匀，冷至约55--60℃时倾注平皿。凝固后放置4℃冰箱保存，一周内用完。

4.8麦康凯琼脂

4.8.1成分

蛋白陈20g

氯化钠5g

胆盐(猪、牛等)5g

乳糖10g

琼脂1520g

1写中性红溶液5mL

蒸馏水1000mL

pH7.2

4.8.2制法

将上述成分(中性红和琼脂除外)混合，加热溶解，校正pH，加人琼脂，煮沸溶化后再加人中性红溶

液，摇匀，115℃灭菌20min，待冷至50^-55℃时倾注平皿。凝固后置4℃冰箱保存，一周内使用。

4.9亚硒酸盐增菌液(SF)

4.9.1成分

蛋白脉5g

乳糖4g

磷酸氢二钠4.5g

磷酸二氢钠5.5g

亚硒酸氢钠4g

蒸馏水1000mL

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GB/T14926.43-2001

pH7.0-7.2

4.9.2制法

先将亚硒酸盐加到200mL蒸馏水中，充分摇匀溶解。混合其它成分，加人蒸馏水800mL，加热溶

解，待冷却后两液混合，充分摇匀，校正pH值(调整磷酸盐缓冲对的比例来校正)。最后分装中试管，每

管5mL，置水浴隔水煮沸10^15min，立即冷却，4℃冰箱保存，一周内使用。

4.10李氏增菌肉汤(LB1,LB2)

4.10.1成分

胰蛋白膝59

多价陈5g

酵母浸膏59

氯化钠59

磷酸二氢钾1.35g

磷酸氢二钠12g

七叶昔1g

蒸馏水1000mL

4.10.2制法

将上述成分加热溶解，调pH至7.2-7.4，分装，1210C15min灭菌。

LB1:

225mL中加人1写蔡陡酮酸(用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制)0.45mL

1%丫咙黄(用灭菌蒸馏水配制)0.27mL

LBZ:

200mL中加人1纬禁吮酮酸0.40mL

1%丫陡黄。50mL

分装中试管，每管5mL,

4.11改良的McBride琼脂(MMA)

4.11.1成分

胰蛋白脉59

多价脉59

牛肉膏3g

葡萄糖19

抓化钠5g

磷酸氢二钠