DB15/T 2555-2022 原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技术规程-乳汁分离法

ICS65.020.30

CCSB40

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内蒙古自治区地方标准

DB15/T2555—2022

原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技

术规程-乳汁分离法

Technicalregulationoftheisolation,primarycultureand

identificationofBovineMammaryEpithelialCellsderivedfromfresh

milk

2022-04-25发布2022-05-25实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T2555—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。

本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古大学。

本文件主要起草人：杜瑞平、王潇、特日格勒、张兴夫、崔新洁、赵濛、云伏雨、张春华、羿静、

康长清。

I

DB15/T2555—2022

原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技术规程-乳汁分离法

1范围

本文件规定了乳汁分离法培养鉴定原代奶牛乳腺上皮细胞的术语与定义、材料、仪器和试剂耗材、

操作步骤等技术要求与规范。

本文件适用于从奶牛乳汁中分离培养和鉴定原代奶牛乳腺上皮细胞。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

原代奶牛乳腺上皮细胞primarybovinemammaryepithelialcells

从奶牛乳汁或乳腺中分离、培养并鉴定出来的上皮细胞。

免疫荧光技术immunofluorescencetechnique

又称荧光抗体技术，是以荧光物质标记抗体，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的检测

和定位。

染色体组型分析karyotypeanalysis

对不同生物的染色体组型（有丝分裂中期的染色体数目及其特征）进行定性和定量的分析和研究。

4材料

乳汁来源

泌乳前期（22d～100d）健康奶牛。

取样

用无菌水及75%酒精擦洗奶牛乳房，挤牛乳约500mL分装于灭菌的蓝盖瓶中，37℃保温瓶保温带

回实验室。

1

DB15/T2555—2022

5仪器和试剂耗材

仪器

生物安全柜，CO2培养箱，高压蒸汽灭菌锅（137℃，0.25MPa），普通光学显微镜，超低温冰箱

（-50℃～-86℃），PCR仪，电泳仪，凝胶成像仪，低速冷冻离心机（2000g，-8℃～10℃），低

温高速台式离心机（20000g，-8℃～10℃），酶标仪，恒温水浴锅，倒置荧光显微镜（40x～640

x）。

试剂与耗材

5.2.1试剂

PBS缓冲液，0.25%胰蛋白酶，细胞冻存液，0.4%台盼蓝，MTT(0.5mg/mL)，二甲基亚砜(DMSO)，

总RNA提取试剂盒，DNA水解酶，反转录试剂盒，PCR试剂盒，Taq酶，琼脂糖，4%多聚甲醛，山羊血清

（10%），兔抗人角蛋白8多克隆抗体，FITC标记的山羊抗兔IgG，DAPI（10μg/mL），秋水仙素（5

μg/mL），0.2%TritonX－100，10%Giemsa染色液等。

5.2.2配制溶液组分

完全培养液：10%FBS+DMEM/F12+100U青链霉素双抗+氢化考的松（1μg/mL）+孕酮（1μg/mL）

+转铁蛋白（5μg/mL）+胰岛素（5μg/mL）+谷氨酰胺（200mmol/L）+EGF（10ng/mL）。

核型分析固定液：甲醇：冰醋酸为3:1。

5.2.3耗材

T25细胞培养瓶，96孔细胞培养板，90mm培养皿，0.22μM滤膜，15mL/50mL离心管，2mL细胞

冻存管，无酶PCR管，移液器，血球计数板等。

6操作步骤

分离培养

6.1.1分离

6.1.1.1在生物安全柜中，将200mL乳汁与含青链霉素双抗（100U/mL）的PBS按体积比2：1