DB37/T 2031-2012 奶牛DNA亲子鉴定技术规程

ICS65.020.01

B40

DB37

山东省地方标准

DB37/T2031—2012

奶牛DNA亲子鉴定技术规程

TechnicalSpecificationforDNAParentageIdentificationinDairyCattle

2012-02-09发布2012-03-01实施

山东省质量技术监督局发布

DB37/T2031—2012

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由山东省畜牧兽医局提出。

本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省畜牧总站、山东奥克斯生物技术有限公

司。

本标准主要起草人：黄金明、张思聪、鞠志花、李建斌、李荣岭、李秋玲、侯明海、曲绪仙、仲跻

峰。

I

DB37/T2031—2012

奶牛DNA亲子鉴定技术规程

1范围

本标准规定了奶牛DNA亲子鉴定的技术方法。

本标准适用于奶牛DNA亲子鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法

NY/T1672-2008绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程

SN/T1193基因检验实验室技术要求

SN/T1917-2007牛地方流行性白血病聚合酶链反应操作规程

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

亲子鉴定（parentageidentification）

利用分子遗传学、生物学及医学的理论和技术判断亲代与子代是否具有血缘关系。

3.2

亲权指数(paternityindex,PI)

假设亲代提供生父（母）基因成为孩子生父（母）的可能性和随机亲代亲提供生父（母）基因成为

孩子生父（母）的可能性的比值。

3.3

LOD值

亲权指数的对数值。

3.4

亲权（父、母）相对机会（Relativechancepaternity，RCP）

表示疑似亲代是真实亲代的机会。

RCP的计算：

1

DB37/T2031—2012

PI

RCP=..........................(1)

PI+1

式中：

PI—亲权指数。

多个标记累计的PCP计算：

累计RCP=1−1−∏（1−RCPI）.............................(2)

式中：

RCPi—第i标记的RCP。

3.5

微卫星（DNAmicrosatellite）

也称短串联重复序列(STR)或简单重复序列(SSR)。是一类广泛存在于真核生物基因组中的，核心

序列为2～6bp,重复次数通常为15～30次的DNA串联重复序列。

3.6

多重聚合酶链反应（multiplexPCR）

又称多重引物PCR或复合PCR，是指在同一PCR反应体系中加入两对以上引物，同时扩增出多个核酸

片段的PCR反应。

4鉴定原理

利用常染色体微卫星分型技术，选取不同染色体上的微卫星位点，采用多重PCR技术扩增微卫星标

记，检测微卫星位点的遗传多态性，分型得出各位点等位基因的大小，通过软件统计分析，确定或排除

亲子关系。

5主要试剂配制

除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682的双蒸水；高压灭菌条件为1.034×105Pa

压力，蒸汽灭菌20min。试剂配制见附录A。

6主要仪器设备

见附录B。

7检测方法

7.1样本采集

静脉采集血样3～5mL，ACD抗凝，4℃或-20℃保存。对公牛，亦可采集2～3剂细管精液，液氮保存。

7.2DNA提取

2

DB37/T2031—2012

7.2.1血液DNA的提取

用酚-氯仿抽提法从抗凝血和血凝块中提取基因组DNA。抗凝血和血凝块的处理按照SN/T1917-2007

的规定执行。DNA的提取按照NY/T1672-2008中的规定执行。也可用商业化DNA提取试剂盒提取DNA。

7.2.2精液DNA提取

从细管中取出精液放入1.5mL离心管中，然后，加入500µL生理盐水，混匀，12000rpm离心1min，

弃除上清液，保留底部的白色沉淀。重复上述步骤一次。加入精子DNA抽提液400µL及5µL蛋白酶K，旋

涡混合器悬浮；56℃消化10～12h，至溶液澄清透明；加入300µL苯酚，轻轻混匀，12000rpm离心10min；

小心吸取上清液，转至1.5mL离心管中，加入150µL酚和150µL氯仿，轻轻混合5min；吸取上清液，加入

500µL无水乙醇（4℃保存），轻轻颠倒混合；用灭菌枪头将白色沉淀挑出，1mL的70%乙醇洗涤，凉干，

加入400µL双蒸水，充分溶解，4℃或-20℃保存。

7.3DNA浓度和纯度检测

按照NY/T1672-2008的规定执行。

7.4引物序列

引物序列参考联合国粮农组织(FAO)和国际动物遗传学会(ISAG)的推荐引物。12个微卫星标记分为4

个扩增组合，具体见附录C。

7.5PCR扩增

7.5.1多重PCR扩增体系

产物扩增分4次PCR反应完成。同一扩增组合的引物加入同一PCR反应管中。25µL反应体系：10×

Buffer2.5µL、50mmol/LMgCl21.2µL、10mmol/LdNTP0.6µL、TaqDNA聚合酶2U、10µmol/L引物(扩增

组合)各1.0µL、待测个体模板DNA（或者阳性对照DNA）100ng、加双蒸水至反应总体积为25µL。PCR扩

增时设计阴性对照（双蒸水作为模板）。

7.5.2PCR扩增条件

94℃预变性5min；94℃变性30s，57～60.5℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min，

4℃保存。

7.6PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测

7.6.1先用水清洗制胶板，再用1×TAE冲洗一次，水平放置。

7.6.2根据电泳胶板的规格和检测样品的数量，配制1%的琼脂糖溶液，在微波炉中加热融化至溶液澄

清透明，室温下冷却至60℃左右时，加入溴化乙锭并混匀，使EB的终浓度为0.5μg/mL。

7.6.3将混合液缓慢倒入制胶板中，排除气泡，插入多齿梳子。待凝胶凝固后，拔出梳子，将凝胶转

移至水平电泳槽中，往电泳槽中加入1×TAE缓冲液，使电泳缓冲液没过胶面。

7.6.4将待检PCR产物5µL和上样缓冲液（6×DNALoadingBuffer）以5:1的比例混合均匀，加入

点样孔；同时选择点样孔点上5µL2000bpDNAMarker作参照。恒压100V，电泳30min。电泳结束后

于凝胶成像系统观察,并分析记录。

7.7微卫星DNA多态性分析

3

DB37/T2031—2012

PCR产物、去离子甲酰胺和TAMRA内标按0.5µL:lOµL:O.5µL比例混合，95℃变性5min，ABIPRISM

3100仪器测序，ABIPRISM3100DATACOLLECTION软件分析微卫星的基因型。FAM、HEX和TAMRA分别表

示蓝色、绿色和黑色。

8结果判定

8.1多重PCR产物检测