DB22/T 2078-2014 鹿源结核杆菌基因分型 MLVA法

ICS11.220

B41

DB22

吉林省地方标准

DB22/T2078—2014

鹿源结核杆菌基因分型MLVA法

MLVAMethodforGenotypingofMycobacteriumTuberculosisfromDeer

2014-05-04发布2014-06-01实施

吉林省技术质量监督局发布

DB22/T2078—2014

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。

本标准由中华人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、吉林农业大学、吉林省中韩动物科学研

究院。

本标准主要起草人：王春雨、杨莉、李忠平、石建平、王全凯、孙磊、宋立品、孔德鑫。

I

DB22/T2078—2014

鹿源结核杆菌基因分型MLVA法

1范围

本标准规定了鹿源结核杆菌MLVA分型方法。

本标准适用于鹿源结核杆菌MLVA基因分型。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）

适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

SN/T2025动物检疫实验室生物安全操作规范

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

3.1MLVA:多位点可变数目串联重复序列分析

3.2DNAmarker：脱氧核糖核酸分子标记

3.3SDS:十二烷基硫酸钠

3.4PCR:聚合酶链式反应

3.5Tris-HCl:三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液

3.6EDTA：乙二胺四乙酸

4生物安全要求

操作过程的生物安全措施应遵守GB19489和SN/T2025的有关规定。

5原理

多位点数目可变串联重复序列分型(multiplelocusVNTRsanalysis，MLVA)以PCR扩增为基础，利

用PCR方法扩增散在于菌株基因组中的不同独立位点可变数目串联重复序列(VNTR)，对扩增产物进行DNA

分析确定长度，根据不同位点重复序列单拷贝长度计算出拷贝数，由不同位点拷贝数组成菌株基因型。

6材料与试剂

6.1实验用水：本实验用水为符合GB/T6682要求双蒸水。

6.250bpDNAmarker

1

DB22/T2078—2014

6.310%SDS：10g的SDS粉末溶解于70ml双蒸水中，定容到100ml。

6.4PCR扩增预混液

6.51MTris-HCl(pH8.0):称取Tris碱6.06g，加双蒸水40ml溶解，滴加浓HCl调pH至8.0，

定容至50ml。

6.60.5MEDTA(pH8.0):称取EDTA-Na2·2H2O9.306g，加双蒸水35ml，搅拌，用NaOH调pH至

8.0，定容至50ml。

6.7苯酚/三氯甲烷/异戊醇（体积比25；24；1）

6.8三氯甲烷

6.9CTAB裂解液：2％CTAB，1.4mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)，0.02mmol/LNa2-EDTA

(pH8.0)。

6.10CTAB沉淀液：0.5％CTAB，0.04mmol/LNaCl。

6.11TE缓冲液:称取1MTris-HCl(pH8.0)1ml和0.5MEDTA(pH8.0)0.2ml，加加双蒸水定

容至100ml。

6.12PCR引物

本规程选择13个MLVA位点作为扩增位点，各位点引物见表1，引物保存于-20℃，临用前取出用双

蒸水稀释为10pmol/μl，置-20℃保存。

表1MLVA位点扩增引物

位点名称引物名称序列(5'to3')碱基数

QUB-11baCGTAAGGGGGATGCGGGAAATAGG24

QUB-11b

QUB-11bbCGAAGTGAATGGTGGCAT18

MIRU4aGCGCGAGAGCCCGAACTGC