GB/T 21981-2008 动物源食品中激素多残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法

ICS67.120

X04QB

中华人民共和国国家标准

GB/T21981—2008

动物源食品中激素多残留检测方法

液相色谱-质谱质谱法

Determinationofhormonemultiresiduesinfoodstuffsof

animalorigin—LC-MS/MSmethod

2008-06-06发布2008-07-03实施

发布

GB/T21981—2008

本标准附录A和附录B为规范性附录，附录C、附录D、附录E、附录F和附录G均为资料性附录。

本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。

本标准由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会归口。

本标准起草单位：北京市疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、中国检验

检疫科学研究院。

本标准主要起草人:邵兵、杨奕、张晶、吴永宁、储晓刚。

T

GB/T21981—2008

动物源食品中激素多残留检测方法

液相色谱-质谱质谱法

1范围

本标准规定了动物源食品中激素残留量的液相色谱-质谱质谱测定方法。

本标准适用于猪肉、猪肝、鸡蛋、牛奶、牛肉、鸡肉和虾等动物源食品中50种激素〔见附录A）残留的

确证和定量测定。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有

的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究

是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992,neqISO3696：1987）

3方法提要

试样中的目标化合物经均质，酶解，用甲醇-水溶液提取，经固相萃取富集净化，液相色谱-质谱质

谱仪测定，内标法定量。

4试剂和材料

除特殊注明外，本标准所用试剂均为色谱纯，水为GB/T6682规定的一级水。

4.1甲醇。

4.2二氯甲烷。

4.3乙睛。

4.4甲酸。

4.5乙酸:分析纯。

4.6乙酸钠（NaAC・4H2O）：分析纯。

4.70-葡萄糖醛酸酶芳香基硫酸酯酶溶液（/3-glucuronidase/arylsulfatase）:4.5U/mL/?-葡萄糖醛酸

酶，14U/mL芳香基硫酸酯酶。

4.8乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH5.2）：称取43.0g乙酸钠（NaAC•4H2O）,加入22mL乙酸，用水溶

解并定容到1000mL,用乙酸调节pH到5.2。

4.9甲醇-水溶液（1+1,体积比）：取50mL甲醇和50mL水混合。

4.10二氯甲烷-甲醇溶液（7+3,体积比）：取70mLz：氯甲烷和30mL甲醇混合。

4.110.1%甲酸水溶液:精确量取甲酸1mL加水稀释至1000mLo

4.12标准品：去甲雄烯二酮、群勃龙、勃地酮、氟甲睾酮、诺龙、雄烯二酮、睾酮、普拉雄酮、甲睾酮、异睾

酮、表雄酮、康力龙、17彷轻基雄烷-3-酮、美睾酮、达那醴、美雄诺龙、轻甲雄烯二酮、美雄醇、雌二醇、雌三

醇、雌酮、烘雌醇、己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚、烘诺酮、21旷轻基孕酮、17旷轻基孕酮、左烘诺孕酮、

甲轻孕酮、乙酸甲地孕酮、孕酮、甲轻孕酮乙酸酯、乙酸氯地孕酮、曲安西龙、醛固酮、泼尼松、可的松、氢

化可的松、泼尼松龙、氟米松、地塞米松、乙酸氟氢可的松、甲基泼尼松龙、倍氯米松、曲安奈德、氟轻松、

氟米龙、布地奈德、丙酸氯倍他索，纯度均大于97%。物质英文名称及CAS号见附录A。

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GB/T21981—2008

4.13同位素内标：烘诺孕酮-4、孕酮-£、甲地孕酮乙酸酯-也、甲轻孕酮-也、美仑孕酮-也、烘诺酮$C2、

氯睾酮乙酸酯-也、氯睾酮-也、16彷轻基司坦輕醇-£、甲睾酮-氏、勃地龙-d：八氢化可的松-也、睾酮$C2、雌

酮-也、雌二醇)C2、己烯雌酚-山、己二烯雌酚-也、己烷雌酚-山，物质英文名称见附录E。

4.14标准储备液：分别准确称取10.0mg的标准品及内标于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至

刻度制成1.0mg/mL标准储备液，一18"C以下保存，标准储备液在12个月内稳定。

4.15混合内标工作液:用甲醇将各标准储备溶液配制成浓度为100Mg/L的混合内标工作液。

4.16混合标准工作液:根据需要，用甲醇-水溶液(4.9)将各标准储备溶液配制为适当浓度(0.5,1,2,

5,10,20和40速/L,其中烘诺酮、表雄酮、布地奈德、17肾轻基雄烷-3-酮、氟米龙、氟甲睾酮为其他化合

物浓度的5倍)，标准工作溶液中含各内标浓度为10卩g/L。

4.17ENVI-Carb固相萃取柱(500mg,6niL)或相当者，使用前依次用6rnL二氯甲烷-甲醇溶液

(4.10)、6mL甲醇、6mL水活化。

4.18氨基固相萃取柱(500mg,6mL),使用前用6mL二氯甲烷-甲醇溶液(4.10)活化。

5仪器

5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪：配有电喷雾离子源。

5.2电子天平：感量为0.0001g和0.01g。

5.3组织匀浆机。

5.4涡旋混合器。

5.5恒温振荡器。

5.6超声清洗仪。

5.7离心机：10000r/mino

5.8固相萃取装置。

5.9氮吹仪。

5.10pH计。

5.11移液器。

6试样制备

6.1动物肌肉、肝脏、虾

从所取全部样品中取出有代表性样品约500g,剔除筋膜，虾去除头和壳。用组织捣碎机充分捣碎

均匀，均分成两份，分别装入洁净容器中，密封，并标明标记，于一18C以下冷冻存放。

6.2牛奶

从所取全部样品中取出有代表性样品约500g,充分摇匀，均分成两份，分别装入洁净容器中，密封，

并标明标记，于0€〜4C以下冷藏存放。

6.3鸡蛋

从所取全部样品中取出有代表性样品约500g,去壳后用组织捣碎机充分搅拌均匀，均分成两份，分

别装入洁净容器中，密封，并标明标记，于0°C〜4C以下冷藏存放。

注：制样操作过程中应防止样品被污染或其中的残留物发生变化。

7分析步骤

7.1提取

称取5g试样(精确至0.01g)于50mL具塞塑料离心管中，准确加入内标溶液(4.15)1000.和

10mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液(4.8),涡旋混匀，再加入彷葡萄糖醛酸酶芳香基硫酸酯酶溶液100#L,于

37C士1C振荡酶解12h。取出冷却至室温，加入25mL甲醇超声提取30min,0°C~4°C下

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10000r/min离心10mino将上清液转入洁净烧杯，加水100mL,混匀后待净化。

7.2净化

提取液（7.1）以2mL/min~3mL/min的速度上样于活化过的ENVI-Carb固相萃取柱（4.17）。将

小柱减压抽干。再将活化好的氨基柱串接在ENVI-Carb固相萃取柱下方。用6rnL二氯甲烷-甲醇溶

液（4.10）洗脱并收集洗脱液，取下ENVI-Carb小柱，再用2mL二氯甲烷-甲醇溶液（4.10）洗氨基柱，洗

脱液在微弱的氮气流下吹干，用1mL甲醇-水溶液（4.9）溶解残渣，供仪器测定。

8测定

&1雄激素、孕激素、皮质醇激素测定

&1.1液相色谱条件

a）色谱柱:ACQUITYUPLC™BEH5柱，2.1mm（内径）X100mm,1.7“i,或相当者。

b）流动相：A,0.1%甲酸水溶液（4.11）；B,甲醇。梯度淋洗,参考梯度条件参见表C.1。

c）流速：0.3mL/min。

d）柱温：4（TC。

e）进样量:10（uLo

&1.2雄激素、孕激素测定参考质谱条件

a）电离源：电喷雾正离子模式。

b）毛细管电压：3.5kVo

c）源温度：100C。

d）脱溶剂气温度：450ro

e）脱溶剂气流量：700L/h0

f）碰撞室压力：0.31Pa（3.1X10-3mbar）o

g）雄激素、孕激素的特征离子参见表D.1和表D.2”

&1.3皮质醇激素测定参考质谱条件

a）电离源：电喷雾负离子模式。

b）毛细管电压：3.0kVo

c）源温度：100°Co

d）脱溶剂气温度：450C。

e）脱溶剂气流量：700L/h0

f）碰撞室压力：0.31Pa（3.1X103mbar）o

g）皮质醇激素的特征离子参见表D.3,

&2雌激素测定

&2.1雌激素测定液相色谱条件

a）色谱柱:ACQUITYUPLC™BEHG*柱，2.1mm（内径）X100mm,1.7“i,或相当者。

b）流动相：A,水；B,乙月青。梯度洗脱,参考梯度条件参见表C.2。

c）流速：0.3mL/min。

d）柱温：4（TC。

e）进样量:10（uLo

&2.2雌激素测定质谱条件

a）电离源：电喷雾负离子模式。

b）毛细管电压：3.0kVo

c）源温度：100C。

d）脱溶剂气温度：45（TC。

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e）脱溶剂气流量：700L/h0

f）碰撞室压力：0.31Pa（3.1X1O-3mbar）o

g）雌激素的特征离子参见表D.4O

9定性

各测定目标化合物的定性以保留吋间和与两对离子（特征离子对定量离子对）所对应的LC-MS/MS

色谱峰相对丰度进行。要求被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留吋间一

致，同吋被测试样中目标化合物的两对离子对应的LC-MS/MS色谱峰丰度比与标准溶液中目标化合

物的色谱峰丰度比一致，允许的偏差见表lo

表1定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差

相对离子丰度>50%>20%至50%>10%至20%<10%

允许的相对偏差±20%±25%±30%±50%

10定量

本标准采用内标法定量。各物质对应内标见表A.1。

每次测定前配制标准系列（4.14）,按浓度由小到大的顺序，依次上机测定，得到目标物浓度与峰面

积比的工作曲线。标准溶液的液相色谱-质谱质谱多反应监测（MRM）色谱图参见图E.1。

11计算

按式（1）计算试样中检测目标物残留量（Mg/kg）:

m

式中：

X；——试样中检测目标化合物残留量，单位为微克每千克（ptg/kg）；

5——由回归曲线计算得到的上机试样溶液中目标化合物含量，单位为微克每升（卩g/L）；

V——浓缩至干后试样的定容体积，单位为毫升（mL）；

>n试样的质量，单位为克（g）0

12测定低限和回收率

按能够准确确认的目标化合物浓度来估计各目标化合物在不同样品基质的检出限，样品基质、取样

量、进样量、色谱分离状况、电噪声水平以及仪器灵敏度均可能对样品检出限造成影响，因此噪声水平应

从实际样品谱图中获取。当某目标化合物的结果报告未检出吋应同吋报告样品检出限。

采用上述方法，50种激素在不同基质中的测定低限为0.4Mg/kg〜2.0Mg/kg（参见表F.1）。各化

合物的加标回收率在75.2%〜121.8%之间，相对标准偏差为2.4%〜20.8%（参见表G.1和表G.2）„

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附录A

（规范性附录）

50种激素物质的英文名称、CAS号及对应的内标物质

表A.150种激素物质的英文名称、CAS号及对应的内标物质

化合物英文名CAS号内标物质

去甲雄烯二酮19-nor-4-androstene-317-dione734-32-7勃地酮

群勃龙trenbolone10161-33-8勃地酮-心

勃地酮boldenone846-48-0勃地酮-心

氟甲睾酮fluoxymesterone76437勃地酮d3

诺龙nandrolone434-22-0勃地酮-心

雄烯二酮4-androstene-3,17-dione734-32-7睾酮』G

美雄酮methandrostenolone72-63-9睾酮』G

睾酮testosterone58-22-0睾酮』G

普拉雄酮dehydroepiandrosterone53-43-0睾酮』G

甲睾酮methyltestosterone5858-18-4甲睾酮

异睾酮testostrone—睾酮』G

美雄醇methylandrostenediol521-10-8甲睾酮

表雄酮epiandrosterone481-29-8甲睾酮

康力龙stanozolol10418-03-816护轻基司坦吐醇a

17/3■羟基雄烷-3-酮5a-androstan-17y3-ol-3-one521-18-6氯睾酮-山

美睾酮mesterolone1424-00-6氯睾酮-心

达那睦danazol17230-88-5氯睾酮乙酸酯-心

美雄诺龙mestanolone521-11-9氯睾酮乙酸酯

烘诺酮19-norelhindrone68-22-4烘诺酮」弋2

21旷羟基孕酮2la-hydroxyprogesterone64-85-7美仑孕酮一山

17旷兒基孕酮17a-hydroxyprogesterone68-96-2美仑孕酮一山

甲基烘酮D-(-)-norgestrel797-63-7烘诺孕酮*6

甲羟孕酮medroxyprogesterone520-85-4甲瓮孕酮-心

乙酸甲地孕酮megestrolacetate595-33-5甲地孕酮乙酸酯-氏

乙酸氯地孕酮chlormadinoneacetate302-22-7甲地孕酮乙酸酯-ds

孕酮progesterone57-83-0孕酮

甲羟孕酮乙酸酯medroxyprogesterone71-58-9甲地孕酮乙酸酯-心

曲安西龙triamcinolone124-94-7氢化可的松

醛固酮aldosterone52-39-1氢化可的松

泼尼松prednisone53-03-2氢化可的松

可的松cortisone53-06-5氢化可的松-心

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表A.1（续）

化合物英文名CAS号内标物质

氢化可的松cortisol50-23-7氢化可的松-山

泼尼松龙prednisolone50-24-8氢化可的松

氟米松flumethasone2135-17-3氢化可的松

地塞米松dexanethasone50-02-2氢化可的松-心

乙酸氟氢可的松fludrocortisoneacetate514-36-3氢化可的松-心

甲基泼尼松龙methylprednisolone83-43-2氢化可的松

倍氯米松beclomethasone4419-39-0氢化可的松-心

曲安奈德triamcinoloneacetonide76-25-5氢化可的松-心

氟轻松fluocinoloneacetonide67-73-2氢化可的松

氟米龙fluormetholone426-13-1氢化可的松

布地奈德budesonide51333-22-3氢化可的松

丙酸氯倍他索clobetasolpropionate25122-46-7氢化可的松-心

雌三醇estradiol50-27-1雌二醇』G

雌二醇estriol50-28-2雌二醇川G

烘雌醇ethinylestradiol57-63-6雌酮-込

雌酮estrone53-16-7雌酮-込

己烯雌酚diethylstilbestrol6898-97-1己烯雌酚*6

己烷雌酚hexestrol84-16-2己二烯雌酚

己二烯雌酚dienestrol84-17-3己烷雌酚-4

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附录B

（规范性附录）

18种内标物质的英文名称

表B.118种内标物质的英文名称

化合物英文名

烘诺孕酮-4norgestrel-df>

孕酮progesterone-d<)

甲地孕酮乙酸酯megestrol-d3acetate

甲軽孕酮mcdroxyprogcstcronc-d3

美仑孕酮一&melengestrol-d^

烘诺酮』C2northindrone-ethynyl-13C2

氯睾酮乙酸酯-心chlortestosteroneacetate-d^

氯睾酮-心chlortestosterone-

16/3■羟基司坦业醇-&16/3-hydroxy-stanozo101-d3

甲睾酮-d；：methyltestosterone-d3

勃地酮-cl：：17yj-boldenone-d3

氢化可的松-小cortisol-d^

睾酮testosterone-3,4-13C2

雌酮estrone-2,4-d2

雌二醇』C2estradiol-3,4-13C2

己烯雌酚-4diethylstill疋strol-c^

己二烯雌酚-込dienestrol-d2

己烷雌酚-山hexestrol-d.i

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附录C

（资料性附录）

参考液相色谱条件

表C.1雄激素、孕激素、皮质醇激素参考液相色谱条件

时间minA/%B/%

05050

83664

111684

12.50100

14.50100

155050

175050

表C.2雌激素参考液相色谱条件

时间minA/%B/%

06535

45050

4.50100

5.50100

5.66535

96535

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附录D

(资料性附录)

参考质谱条件"

表D.1雄激素参考质谱条件

保留时间母离子锥孔电压子离子碰撞能量

化合物

min(m/z)V(m/z)eV

108.9a25

去甲雄烯二酮4.28273.442

197.318

253.3a18

群勃龙4.41271.433

199.324

121.0a22

勃地酮4.80287.622

13515

241.0a22

氟甲睾酮4.87337.733

131.030

109.la26

诺龙5.18275.635

257.415

96.9a20

雄烯二酮5.25287.625

10&923

149.0a15

美雄酮5.58301.022

121.026

97.Is22

睾酮6.22289.438

109.120

271.0a10

普拉雄酮6.92289.513

253.110

109.la27

甲睾酮7.35303.520

97.125

187.0a18

异睾酮7.40289.330

205.115

269.la11

美雄醇7.60287.416

159.121

273.5a16

表雄酮7.86291.415

255.28