DB45/T 2754-2023 芒果品种鉴定技术规程 SSR分子标记法

ICS65.020.20

CCSB05

45

广西壮族自治区地方标准

DB45/T2754—2023

芒果品种鉴定技术规程SSR分子标记法

CodeofpracticeidentificationofmangovarietiesbySSRmolecular

markermethod

2023-08-10发布2023-09-30实施

广西壮族自治区市场监督管理局发布

DB45/T2754—2023

目次

前言.................................................................................II

1范围...............................................................................1

2规范性引用文件.....................................................................1

3术语和定义.........................................................................1

4缩略语.............................................................................1

5原理...............................................................................2

6材料和试剂.........................................................................2

6.1一般规定.......................................................................2

6.2试剂...........................................................................2

6.3溶液配制.......................................................................2

7仪器和设备.........................................................................3

8SSR引物序列信息....................................................................3

9操作步骤...........................................................................4

9.1样品采集.......................................................................4

9.2DNA提取........................................................................4

9.3PCR扩增........................................................................4

9.4PCR产物检测....................................................................4

10数据记录与统计....................................................................5

10.1数据记录......................................................................5

10.2统计..........................................................................5

11结果判定..........................................................................6

11.1判定方法......................................................................6

11.2结果表述......................................................................6

附录A（规范性）引物序列信息.........................................................7

I

DB45/T2754—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由广西检验检疫标准化技术委员会提出、归口并宣贯。

本文件起草单位：广西益谱检测技术有限公司、广西博测检测技术服务有限公司、广西智标云信息

科技有限公司、广西绿保环境监测有限公司、南宁海关技术中心、广西壮族自治区种子管理站、百色市

检验检测中心、南宁维尔凯生物科技有限公司。

本文件主要起草人：赵永锋、莫薇、何京明、杨桂强、罗贵文、梁俊、薛海燕、黄小娟、莫璋红、

刘新彩、郑美玲、黄鹂、李丽、吴妮、官月香、韦东、梁群清、苏丽梅、仝丹丹、刘守廷。

II

DB45/T2754—2023

芒果品种鉴定技术规程SSR分子标记法

1范围

本文件界定了芒果品种鉴定技术的相关术语和定义，规定了利用简单重复序列（simplesequence

repeat，SSR）分子标记法进行芒果品种鉴定的原理、材料和试剂、仪器设备、引物序列信息、操作步

骤、数据记录和统计、结果判定。

本文件适用于广西壮族自治区行政区域内基于SSR分子标记的芒果品种SSR指纹数据采集和品种鉴

定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T2594植物品种鉴定DNA分子标记法总则

3术语和定义

NY/T2594界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

3.1

核心引物coreprimer

品种鉴定中优先选用一套简单重复序列（SSR）引物，其检测位点具有多态性高、重复性好等综合

特性。

3.2

对照品种controlvariety

具有所用SSR位点上不同等位变异的特性，用于辅助确定待测样品的等位变异，校正仪器设备的系

统误差的一类品种。

3.3

聚合酶链式反应polymerasechainreaction

利用DNA在体外摄氏95℃高温时变性会变成单链，低温（经常是60℃左右）时引物与单链按碱基互

补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72℃左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖

（5'-3'）的方向合成互补链。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

SSR：简单重复序列（SimpleSequenceRepeat）。

PCR：聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction）。

DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyriboNucleicAcid）。

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DB45/T2754—2023

5原理

不同品种芒果的基因组成不同，其基因组中SSR的重复次数存在差异，根据SSR的差异，通过PCR扩

增及电泳技术可以鉴定芒果品种。

6材料和试剂

6.1一般规定

除另有说明外，本文件中使用分析纯（含）以上试剂，水为符合GB/T6682规定的二级水，其中PCR

用水要求达到一级水指标。

6.2试剂

6.2.1三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3）：纯度＞99.0％。

6.2.2乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）：纯度≥99.0％。

6.2.3硼酸（H3BO3）：ρ=1.43g/cm³，含量≥99.5％。

6.2.4十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）：ρ=1.32g/mL，纯度≥99.0％。

6.2.5氯化钠（NaCl）：ρ=2.165g/cm³，含量≥99.5％。

6.2.6琼脂糖。

6.2.7过硫酸铵（(NH4)2S2O8）：ρ=1.98g/cm³，含量≥98.0％。

6.2.8氢氧化钠(NaOH）：ρ=2.13g/cm³，含量≥96.0％。

6.2.9硝酸银（AgNO3）：ρ=4.35g/cm³，含量≥98.0％。

6.2.10甲醛（HCHO）：ρ=0.815g/cm³。

6.2.11液氮（N2）：ρ=0.81g/cm³。

6.2.12三氯甲烷（CHCl3）：ρ=1.50g/cm³。

6.2.13无水乙醇（CH3CH2OH）：ρ=0.79g/cm³，含量≥99.7％。

6.2.14DNA分析仪用LIZ500分子量内标。

6.2.15去离子甲酰胺（CH3NO）：ρ=1.133g/mL。

6.2.1640％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液（Acryl/BisSolution(29:1)）。

6.2.17四甲基乙二胺（TEMED）：ρ=1.32g/mL。

6.2.18DNA分子量标准（DNAmarker）：可以清楚区分50bp～500bp的DNA片段。

6.2.192×TaqPlusPCR预混试剂：0.1U/μLTaqPlusPolymerase、500μmol/LdNTPeach、20mmol/L

Tris-HCl(pH=8.3)、100mmol/LKCl、3mmol/LMgCl2、稳定剂、增强剂。

6.3溶液配制

6.3.15×TBE缓冲液

称取5.4g三羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、0.372g乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）和2.75g硼酸（6.1.3）

溶于70mL一级水中，定容至100mL，在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。

6.3.20.5×TBE缓冲液

量取100mL浓度5×TBE（6.2.1）缓冲液于烧杯中，加入900mL一级水混匀。

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DB45/T2754—2023

6.3.3CTAB提取溶液

称取4g十六烷基三甲基溴化铵（6.1.4）、16.38g氯化钠（6.1.5）、1.21g三羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、

1.49g乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）溶于70mL一级水，定容至200mL，在103.4kPa（121℃）条件下灭

菌20min。

6.3.4无菌一级水

一级水在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。

6.3.51％琼脂糖溶液

1g琼脂糖（6.1.6）溶于100mL的0.5×TBE缓冲液（6.2.2），适当加热融化。

6.3.610％过硫酸铵溶液

称取10g过硫酸铵（6.1.7），加入100mL一级水溶解。

6.3.7电泳缓冲液

称取108g三羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、7.44g乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）、55g硼酸（6.1.3）、

0.8g氢氧化钠（6.1.8），加入10L一级水溶解。

6.3.8染色液

称取0.2g硝酸银（6.1.9），加入400mL一级水溶解。

6.3.9显色液

称取4g氢氧化钠（6.1.8），加入400mL一级水溶解，临用时再加1.6mL甲醛（6.1.10）。

7仪器和设