YY/T 1562-2017 组织工程医疗器械产品 生物材料支架 细胞活性试验指南

ICS11.040.40

C45

中华人民共和国医药行业标准

/—

YYT15622017

组织工程医疗器械产品生物材料支架

细胞活性试验指南

ㅤㅤㅤㅤ

——

TissueenineerinmedicaldeviceroductsBiomaterialscaffolds

ggp

Guideforcellviabilitevaluation

y

2017-03-28发布2018-04-01实施

国家食品药品监督管理总局发布

/—

YYT15622017

引言

/

活性细胞和无活性细胞在生物材料支架表面或内部的数量和分布是决定细胞生物材料支架构建

,。,

物产品性能的重要特征之一也是评价生物材料支架的细胞相容性的指标之一因此作为用于修复与

,。

再生缺损或疾病组织的组织工程产品的重要参数有必要对细胞活性定量检测的方法进行标准化

(),

虽然细胞活性对于组织工程医疗产品TEMP来说是个非常重要的特性但TEMP的生物活性还

。、、、

受其他参数的影响推荐使用其他检测方法以评估和确定细胞类型蛋白表达基因图谱分化过程及

、、。

程度活化状态形态等特性

,。

建议在使用生物材料支架复合细胞之前按照相关要求完成生物材料支架的生物相容性基本检测

ㅤㅤㅤㅤ

Ⅱ

/—

YYT15622017

组织工程医疗器械产品生物材料支架

细胞活性试验指南

1范围

本标准给出了对生物材料支架进行生物学评价时的细胞活性评价指南。

本标准适用于组织工程医疗器械产品的生物材料支架。

2规范性引用文件

。,

下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文

。,()。

件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件

/:

组织工程医疗产品第部分细胞自动计数法

YYT0606.1313

/::

组织工程医疗产品第部分动物源性生物材料残留量测定法荧光染

YYT0606.2525DNA

色法

、

3术语定义和缩略语

ㅤㅤㅤㅤ

3.1术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1.1

活性细胞viablecell

,,。

能够进行新陈代谢活动结构完整具有功能细胞膜的细胞

3.1.2

无活性细胞non-viablecell

不符合3.1.1中列出的活性标准的任何一项要求的细胞。

3.1.3

生物材料支架biomaterialscaffolds

、,、、

具有细胞或生物活性因子迁移结合或输送功能用来替代修复或再生组织的支持物释放载体或

,、、、。

基质用以诊断治疗修复或替换机体组织器官或增进其功能

3.2缩略语

下列缩略语适用于本文件。

:();

BrdU溴脱氧尿苷5-bromo-2-deoxUridine

y

:();

calceinAM钙荧光素乙酰氧基甲酯calceinacetoxmethlester

yy

DAPI:,二脒基苯基吲哚(,);

46--2-46-diamidino-2-henlindole

py

:();

G6PD葡萄糖磷酸脱氢酶lucose-6-hoshatedehdroenase

-6-gppyg

:();

LDH乳酸脱氢酶lactatedehdroenase

yg

1

/—

YYT15622017

:[,二甲基噻唑],二苯基四氮唑溴盐(,),

MTT3-45--2-25-3-45-dimethlthiazol-2-l-25-dihenl-

yypy

);

tetrazoliumbromide

:(,二甲基吡啶苯基)(羧基甲氧基苯基)(磺苯基)四唑内盐[(,

MTS3-45--2--5-3--2-4--2H-3-45-

)()(),];

dimethlthiazol-2-l-5-3-carboxmethoxhenl-2-4-sulfohenl-2H-tetraoliuminnersalt

yyyypypy

:(碘苯基)(硝基苯基)(,二磺基苯基)四唑盐()(

WST2-4--3-4--5-24--2H-1-2-4-lodohenl-3-4-ni-

py

)(,));

trohenl-5-24-disulfohenl-2H-tetrazolium

pypy

:,(),(

双甲氧基硝基磺基苯基四唑羧酰苯胺

XTT23-2--4--5--2H--5-23-Bis2-methox-4-nitro-5-

y

))。

sulfohenl-2H-tetrazolium-5-carboxanilide

py

4概述

、

本标准概述了定量检测有孔或无孔坚硬的或柔软的生物材料支架内部或表面活性细胞和无活性

。

细胞的数量及分布的常用方法这些方法既可以用于测定生长在完整三维生物材料支架或基质内的细

(),()。

胞非破坏性方法也可以用于已经从支架或者基质中提取的细胞破坏性方法

,,

除了提供现有技术的概述本标准也描述了生物材料支架与细胞活性试验特定的相互作用这些相

。,/

互作用能够干扰细胞活性分析的精度另外本标准还描述了如何避免和或者判断生物材料支架与细

胞活性试验相互作用产生的干扰。

,

本标准中大多数方法来源于二维培养的细胞数量分析但是经过调整已能够用于分析三维构建物

。。

内细胞的情况本标准探讨了这些方法的机理和灵敏度部分试验采用二维培养的细胞建立标准曲

,。,

线由此产生的局限性在本标准中也有所说明此外本标准中还就生物材料支架本身对活性检测试验

ㅤㅤㅤㅤ

影响进行了阐述。

,、。

当多种测试方法组合使用时可更为精确地测量活性细胞无活性细胞的数量和分布

,。。

目前有多种静态或动态方法将细胞接种在生物材料支架上每种方法有不同的细胞接种效率

,。

总体来说静态方法相比动态方法的接种效率要低本标准阐述的方法能够协助建立起细胞接种方法

,。

与接种效率的关系并且能够对特定接种方法下的活性细胞数量进行标准化检测

,(

在培养或移植过程中较厚的生物材料支架或者富含细胞的生物材料支架会导致传质障碍物质扩

),,。

散受限造成构建物中央的细胞死亡只有外缘有活性细胞这种活性细胞的空间分布差异可采用本

。,

标准中的检测方法进行定量另外培养方法或者生物反应器条件对于材料内部细胞活性的影响同样

能够通过本标准中的方法进行评估。

5评价方法的选择

()。

表概述了用来定量生物材料支架表面或内部细胞活性的方法但不限于这些方法需要注意

5.11

,,,

的是这些方法常需要联合应用以确定活性细胞和无活性细胞的总数量另外可进一步检测具有增殖

。,。

活性的细胞数量增殖的细胞具有活性但活性细胞不一定都增殖即使无活性细胞结构不完整或不

,

能进行完整的新陈代谢行为仍可以采用使染料通过破损的细胞质膜进入细胞的方法将无活性细胞鉴

定出来。

2

/—

YYT15622017

表1细胞检测与评价方法

((

破坏性的需要将细胞从非破坏性的检测时细胞

/

检测指标检测方法

支架或基质上分离)仍然在支架或基质上)

Ⅰ总细胞数目

DNA检测×

结晶紫染色×

Ⅱ活细胞数目

代谢分析(含量)××

ATP

四唑盐试验:,,,

MTTMTSWSTXTT××

AlamarBlue染色×

中性红染色×

葡萄糖消耗试验××

细胞增殖():

合成分析

DNA

×

3胸腺嘧啶或者标记

H-BrdU

:,,

染料排斥试验台盼蓝赤藓红苯胺黑×

流式细胞术分析×

细胞自动计数仪分析×

/ㅤㅤㅤㅤ

Ⅲ活细胞死细胞比率

/

根据质膜完整性利用双重荧光染料的活死

×

检测

非荧光染料排除试验×

流式细胞术分析×

———、

Ⅳ成像细胞密度形态和空间分布

组织切片观察

××

共聚焦显微镜观察××

扫描电子显微镜观察××

磁共振成像观察××

Micro-CT观察××

注:“”表示可以适用。

×

,,

5.2细胞在三维构建物内的总数量包括活性细胞和无活性细胞数量一般可以通过DNA检测分析

(),/。

见6.1.1来确定测定方法见YYT0606.25这些分析是在细胞被破坏性地从生物材料支架上分离

,。,

再被裂解后进行的可以间接地确定细胞总数量由于很多细胞与生物材料支架粘附较牢固在细胞分

。,。

离过程中会对细胞造成破损或丢失因此简单通过人工计数完整染色细胞或未染色细胞并不可靠

,/。

5.3如果采用细胞悬液计数可以采用YYT0606.13的检测方法

,,

5.4如果只确定活性细胞的数量可以使用荧光或比色的新陈代谢指示剂这些指示剂可根据细胞进

。

行新陈代谢活动时对生长培养基发生的化学还原反应产生荧光或者改变颜色新陈代谢试验在生物材

料支架破坏和非破坏形式下都可以使用。

3

/—

YYT15622017

,(

或试验可以在破坏或非破坏形式下使用常用的方法是采用分光光度计来检测见

MTTMTS

)。(),。,

6.2.1AlamarBlue法见6.2.3是一种非破坏性方法需要使用荧光计二维和三维培养环境相比

,。,

即使在相同的细胞数量下细胞的代谢会截然不同因此利用在二维培养的细胞生长曲线来校准在三

维结构上的细胞数量可能是不准确的。

。

值得重视的是代谢试验是直接检测细胞产生的胞内酶的活性尽管酶活性的水