T/CSBM 0050.3-2024 创面修复材料有效性评价 第3部分：刺激因子屏蔽评价方法

范围:本文件规定了创面修复材料体外评价的刺激物浓度确定试验、物理屏蔽细胞活力试验和物理屏蔽细胞迁移试验。 本文件适用于水凝胶或固态创面修复生物材料屏蔽保护创面细胞活力和迁移效果的评价; 主要技术内容:4刺激物浓度确定试验4.1原理将刺激物溶解在培养基中，配成不同梯度已知浓度的样品，按照GB/T 16886.5测定刺激物不同浓度下的细胞毒性，确定刺激物存活率40％、50％和60％的浓度。4.2器具、试剂和耗材、细胞系、刺激物4.2.1器具试验器具如下：a)二氧化碳细胞培养箱；b)恒温水浴摇床；c)高压蒸汽灭菌锅；d)倒置荧光显微镜；e)细胞计数仪；f)恒温水浴摇床；g)酶标仪；h)电子天平；i)液氮罐；j)冷冻离心机；k)96孔板；l)细胞培养瓶或细胞培养皿。4.2.2试剂和耗材试验试剂和耗材如下：a)含10％新生胎牛血清DMEM低糖培养基（含10％FBS?DMEM低糖培养基）；b)二甲基亚砜（DMSO）；c)异丙醇；d)高密度聚乙烯。4.2.3细胞系4.2.3.1试验可使用的细胞系如下：a)成纤维细胞；b)皮肤上皮细胞；c)食管上皮细胞；d)胃黏膜上皮细胞；e)肠黏膜上皮细胞。4.2.3.2对于用于不同部位的修复材料选择合适的细胞系，如用于皮肤的修复材料可用皮肤细胞，用于食管的材料可选择食管上皮细胞。4.2.4刺激物试验可使用的刺激物如下：a)盐酸；b)胃蛋白酶；c)胰蛋白酶；d)过氧化氢；e)细菌内毒素；f)其他。4.3样品制备4.3.1刺激物梯度溶液准确称取刺激物溶解在含10％FBS?DMEM低糖培养基中，配置成不同梯度浓度的刺激物，过滤除菌低温保存备用。根据样品现有的细胞毒性数据，配置10个不同梯度浓度的刺激物。4.3.2阴性对照计算直径为1?cm的高密度聚乙烯双面的面积，按3?cm2/mL加入含10％FBS?DMEM低糖培养基，37?℃、120?r/min摇床中浸提24?h，取上清液使用。4.3.3阳性对照取适量DMSO加入含10％FBS?DMEM低糖培养基内，制备10％DMSO溶液，37?℃、120?r/min摇床中震荡24?h。4.3.4空白对照含10％FBS?DMEM低糖培养基，37?℃、120?r/min摇床中震荡24?h。4.4试验方法按照GB/T 16886.5—2017中附录C规定的MTT细胞毒性试验方法进行，处理条件、检测模型、观察时间按表