T/CSBM 0050.2-2024 创面修复材料有效性评价 第 2 部分：水不溶性材料体外浸提液评价方法

范围:本文件规定了水不溶性创面修复材料体外评价的浸提液制备、细胞增殖试验和细胞迁移试验。 本文件适用于水不溶性创面修复生物材料促进创面细胞增殖和迁移效果的评价，如海绵多孔材料、水凝胶材料等; 主要技术内容:4 浸提液制备在无菌状态下，按照以下条件制备浸提液：a) 浸提温度：37 ℃±1 ℃；b) 浸提时间：24 h±2 h 或 48h±2h 或 72h±2h；c) 浸提介质：无血清培养基；d) 浸提条件：120 r/min 摇床中震荡；e) 样品和浸提介质的比例：按照 GB/T 16886.12—2023 中表 1 的规定进行。5 细胞增殖试验5.1 原理在无血清培养基条件下测定细胞增殖的情况，以无血清培养基为空白对照，含血清培养基为阳性对照。若材料具有促进细胞增殖的作用，则和空白对照相比具有明显细胞增殖反应。5.2 器具、试剂和耗材、细胞系5.2.1 器具试验器具如下：a) 二氧化碳细胞培养箱；b) 恒温水浴摇床；c) 高压蒸汽灭菌锅；d) 倒置荧光显微镜；e) 细胞计数仪；f) 恒温水浴摇床；g) 酶标仪；h) 电子天平；i) 液氮罐；j) 冷冻离心机；k) 96 孔板；l) 细胞培养瓶或细胞培养皿。5.2.2 试剂和耗材试验试剂和耗材如下：a) 含 10％新生胎牛血清 DMEM 低糖培养基（含 10％FBS DMEM 低糖培养基）；b) 无血清培养基；c) CCK-8 试剂。5.2.3 细胞系5.2.3.1 试验可使用的细胞系如下：a) 成纤维细胞；b) 皮肤上皮细胞；c) 食管上皮细胞；d) 胃黏膜上皮细胞；e) 肠黏膜上皮细胞。5.2.3.2 对于用于不同部位的修复材料选择合适的细胞系，如用于皮肤的修复材料可用皮肤细胞，用于食管的材料可选择食管上皮细胞。5.3 样品制备5.3.1 试验样品将浸提液使用无血清培养基稀释成100％、75％、50％、25％、12.5％的浓度。5.3.2 阳性对照含10％FBS DMEM低糖培养基，37 ℃、120 r/min摇床中震荡24 h。5.3.3 空白对照无血清培养基，37 ℃、120 r/min摇床中震荡24h。5.4 试验方法将在对数生长期内的细胞按照1×105个/mL的细胞密度加入到96孔板内，每孔100 μL，6个复孔。在细胞培养箱中培养24h后弃去旧培养基，按照表1规定加入对照组和试验组溶液。于24h、48h