T/CSBM 0050.4-2024 创面修复材料有效性评价 第4部分：体外微血管形成试验评价方法

范围:本文件规定了创面修复材料体外评价的样品制备、血管形成试验和结果分析。 本文件适用于适用于创面修复材料促进创面微血管形成效果的评价; 主要技术内容:5血管形成试验5.1原理人的血管系统负责将营养物质和氧气运送到几乎所有的器官和组织，并将产生的废物通过循环排除体外。血管生成在组织损伤修复中具有很大的作用，血管的缺损会延缓伤口的愈合甚至造成伤口长期不愈。血管新生有利于黏膜损伤后的修复，因此通过EA.HY926细胞探究水凝胶浸提液对于血管形成的影响。器具、试剂和耗材、细胞系5.2.1器具试验器具如下：a)二氧化碳细胞培养箱；b)恒温水浴摇床；c)高压蒸汽灭菌锅；d)倒置荧光显微镜；e)细胞计数仪；f)恒温水浴摇床；g)酶标仪；h)电子天平；i)液氮罐；j)冷冻离心机；k)T25细胞培养瓶；l)24孔板；m)基质胶；n)Image J图像处理软件。5.2.2试剂和耗材试验试剂和耗材如下a)MEM低糖培养基：含10％胎牛血清；b)磷酸缓冲液（PBS）；c)0.25％胰蛋白酶。5.2.3细胞系EA.HY926细胞。5.3样品制备5.3.1试验样品按照4.1、4.2制备。5.3.2空白对照MEM低糖培养基，37?℃、120?r/min摇床中震荡24?h。5.4试验步骤5.4.1EA.HY926细胞培养5.4.1.1细胞复苏将EA.HY926细胞冻存管于37?℃恒温水浴锅内不断晃动，待细胞冻存液完全溶解，将冻存的细胞悬液转移至15?mL离心管内，随后加入MEM低糖培养基，用无菌巴氏吸管吹打均匀后1?000?r/min离心3?min。弃去上清液，用MEM低糖培养基重悬细胞，随后将细胞转移至T25的培养瓶中，在37?℃、5％CO2细胞培养箱中培养，24?h后观察细胞状态，并给细胞换液。5.4.1.2细胞传代当细胞密度约为80％时，吸去培养瓶中原有的培养基，使用PBS轻洗两次，加入1?mL～2?mL?0.25％胰蛋白酶消化3?min～5?min，显微镜观察细胞消化情况，当细胞边缘缩小，贴壁松动时，手指轻叩细胞瓶身，肉眼可见细胞脱落，向培养瓶内加入一定量的MEM低糖培养基终止消化，MEM低糖培养基与0.25％胰蛋白酶的比例为5：1。终止消化后，用移液枪轻轻吹打细胞层，吹打时宜尽量减少气泡的产生，将细胞层吹落、吹散，然后将细胞悬液转移至离心管内，1?000?r/min离心