DB4201/T 520-2017 两系杂交水稻品种纯度SSR鉴定方法

ICS65.020.20

B22

DB4201

武汉市地方标准

DB4201/T520—2017

两系杂交水稻品种纯度SSR鉴定方法

2017-06-20发布2017-07-20实施

武汉市质量技术监督局发布

DB4201/T520-2017

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由武汉市农业委员会归口。

本标准起草单位：中垦锦绣华农武汉科技有限公司、武汉市农业技术推广中心。

本标准主要起草人：徐姮、许树文、昌华敏、熊恒多、李晏斌、刘万里、万元香。

本标准首次发布。

I

DB4201/T520-2017

两系杂交水稻品种纯度SSR鉴定方法

1范围

本标准规定了用SSR分析技术进行两系杂交水稻品种纯度鉴定的原理、仪器设备及试剂、相关试剂

及溶液配制、推荐引物、操作程序、统计与计算的方法。

本标准适用于两系杂交水稻品种纯度的快速鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验

GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定

GB4404.1-2008粮食作物种子第1部分：禾谷类

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

引物

一条互补结合在模板DNA链上的短的单链，提供3'-OH末端作DNA合成的起点，延伸合成模版DNA的互

补链。

3.2

SSR标记

简单序列重复标记

由几个核苷酸（一般为2个～6个）为重复单元的长达几十至几百个核苷酸的串联重复序列；由于

基本单元重复次数的不同，而形成SSR座位的多态性；根据SSR座位两侧保守的单拷贝序列设计一对特异

引物来扩增SSR序列即可揭示其多态性。

3.3

推荐引物

品种纯度鉴定中优先选用的一套SSR引物，其检测位点多态性高，检测结果重复性好。

3.4

聚合酶链式反应

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一种利用酶促反应对特定DNA片段进行体外扩增的技术，该技术以短核苷酸序列作为引物，并使

用一种耐高温的DNA聚合酶，只需非常少量的DNA样品，在短时间内以样品DNA为模版合成上亿个拷

贝。

3.5

两系杂交水稻

两系杂交水稻是利用光温敏不育系水稻为基础，与恢复系杂交生产的杂交稻种子。

3.6

品种纯度

品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。

4原理

品种的不同本质上是由于其遗传物质DNA核苷酸序列的不同所致，利用不同品种其SSR多态性存在差

异的特点达到纯度鉴定目的。简单重复序列（SSR）分布于水稻整个基因组的不同位置上，不同品种每

个位点上重复单位的数目及序列可能不同，因而形成片段长度多态性。由于每个简单重复序列两端的序

列是高度保守的单拷贝序列，因而可根据其两端的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对重复序列进

行扩增，扩增产物通过电泳进行分离，在凝胶成像系统上观察可辨别SSR电泳谱带。通过选用亲本间具

有多态性的SSR引物在杂交种中PCR扩增产物电泳谱带差异，鉴定两系水稻品种纯度。

5仪器设备及试剂

见附录A。

6相关试剂及溶液配制

见附录B。所用试剂均为分析纯。试剂配制用水均应符合GB/T6682的一级水的要求。

7推荐引物

见附录C，其它在本文件中未推荐的亲本间多态性引物也可以使用。

8操作程序

8.1样品制备

8.1.1受检样品的扦样、分样和保存，应符合GB/T3543.2的要求。

8.1.2试样的数量及淘汰值可参考GB/T3543.5要求。检测时将其双亲的标准种子设为对照。

8.2样品DNA提取

8.2.1材料准备

8.2.1.1亲本

2

DB4201/T520-2017

每个亲本取20个单株叶片取等量组织混合制取样品，提供的亲本种子应符合GB4404.1的原种纯度

要求。

8.2.1.2杂交种

每个样品取200粒以上的种子，培养幼苗单株制样应符合GB/T3543.4要求。

8.2.2DNA提取

8.2.2.1亲本DNA的提取

按GB/T3543.4要求的方法培养幼苗取水稻叶片2cm放入研钵中，加液氮充分研磨至粉末状，然后

移入2ml离心管中，加入500ul预热（60℃）的DNA提取液，65℃水浴30min，间隔15分钟颠倒混匀

一次，再加入500ul氯仿-异戊醇（24：1），轻轻混匀。10000rpm离心5min。将上清液400ul转入

另一支含有800ul-20℃预冷乙醇的离心管沉淀DNA，10000rpm离心10min，弃上清液，再用70％乙

醇溶液洗涤2遍，自然条件下干燥后，加入200ul超纯水溶解DNA，检测浓度，将DNA稀释至20