GB/T 35519-2017 化学品 稳定转染人雌激素受体转录活性试验 雌激素激动活性法

ICS13.300；11.100

A80(3B

中华人民共和国国家标准

GB/T35519—2017

化学品稳定转染人雌激素受体

转录活性试验雌激素激动活性法

Chemicals—Stablytransfectedhumanestrogenreceptortranscriptional

activationassay—Detectionofestrogenicagonistsactivation

2017-12-29发2018-07-01实施

GB/T35519—2017

■>r■—>—

刖弓

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准与经济合作与发展组织(OECD)化学品测试方法No.455《Performance-BasedTest

GuidelineforStablyTransfectedTransactivationInVitroAssaystoDetectEstrogenReceptorAgo-

nists》(2012)技术性内容一致。

本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、复旦大学。

本标准主要起草人：陈相、缪文彬、陈青、陈会明、张静、朱洪坤、赵颐晴、蒋伟、姚丽芳、清江、郭春华。

T

GB/T35519—2017

引言

本标准描述利用稳定转染的细胞系检测雌激素受体激动剂的体外转录激活试验方法，包括原理和

功能相似的雌激素受体(Estrogenreceptor,ERs)激动剂，旨在促进类似的或者经改进的检测方法符合

经济合作与发展组织关于危害评估新方法的验证和认可的指导规范。

本标准附录A和附录B已经经过验证。附录A为利用稳定转染人ERa的hERa-HeLa-9903细胞

系检测化学品雌激素活性的转录激活试验，附录B为利用能够表达人ERa的BGlLuc-4E2细胞进行的

雌激素受体转录激活试验。本标准的雌激素受体转录激活试验方法可以在各国间使用，有利于数据

互认。

1998年经济合作与发展组织发起优先项目活动，旨在对现行指导原则进行修订，同时为筛选和测

定潜在的内分泌干扰物制定新的指导原则。经济合作与发展组织的测定、评估潜在内分泌干扰物质的

概念框架于2012年修订。概念框架由5个阶段组成，不同阶段对应生物复杂性的不同阶段。本标准是

第二阶段的“体外试验,提供内分泌作用机制/通路信息”。本标准是鉴定雌激素受体激动剂的体外转录

激活试验方法。

n

GB/T35519—2017

化学品稳定转染人雌激素受体

转录活性试验雌激素激动活性法

1范围

本标准规定了利用稳定转染细胞系检测雌激素受体激动剂的试验的术语和定义、试验原理、试验方

法与步骤、数据和报告。

木标准适用于利用稳定转染细胞系检测雌激素受体激动剂的试验评估化学品类雌激素的生物

活性。

2术语、定义和缩略语

2.1术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.1.1

激动剂agonist

与特定受体结合时能产生某种反应（如转录）的物质。

2.1.2

拮抗剂antagonist

与受体结合后自身不能引起生物反应，但能阻断或抑制激动剂介导的反应的一类受体的配体或化

学品。

2.1.3

抗雌激素活性anti-estrogenicactivity

一种化学品抑制17卜雌二醇介导的雌激素受体作用的能力。

2.1.4

活性炭/葡聚糖处理charcoal/dextrantreatment

细胞培养中的血浆处理方法，可以去除内源性激素和激素结合蛋白。

2.1.5

细胞毒性cytotoxicity

与平行的溶剂对照组相比，对细胞结构或功能产生毒害并最终导致细胞死亡的毒性效应，表现为毒

物暴露后细胞数量减少或细胞功能减弱。

2.1.6

雌激素活性estrogenicactivity

化学品模拟170-雌二醇结合和激活雌激素受体的能力。

2.1.7

性能标准performancestandard

评估一种试验方法在机制和功能方面是否与验证方法一致的标准。包括：

——基本的试验方法；

—-在验证方法中用来证明试验方法可行的最少的对照化学品清单；

1

GB/T35519—2017

——以验证试验为标准，测试试验通过对照品验证其准确性和可靠性的水平。

2.1.8

稳定转染stabletransfection

当DNA被转染到培养的细胞后，整合到细胞基因中，稳定的表达所转染的基因，形成的细胞克隆

用稳定标志物进行筛选（如G418抗性）o

2.1.9

转录激活transactivation；TA

响应特定化学信号（如雌激素与雌激素受体结合信号）的信使核糖核酸合成。

2.1.10

弱阳性对照weakpositivecontrol

对照品中阳性反应较弱的化学品，用于确保试验的准确性。

2.1.11

溶剂对照vehiclecontrol；VC

溶剂单独作为对照。

2.1.12

验收标准accceptabilitycriteria

符合试验控制和参考标准的最低标准。

2.1.13

准确性accuracy

试验结果与公认参考值的接近程度，衡量试验方法的效能和相关性。

2.1.14

熟练度proficiency

检测未知化学品前能正确使用试验方法的能力。

2.1.15

参考标准referencestandard

用于证明试验方法合适的对照品。

2.2缩略语

本标准所用缩略语见表1。

表1缩略语

缩略语中文全称英文金称

STTA稳定转染转录激活试验StablyTransfectedTransactivationassay

E2170-雌二醇17/?-estradiol

ER雌激素受体EstrogenReceptor

RLU相对光单位RelativeLightUnits

HeLa一种永生的人宫颈细胞系Animmortalhumancervicalcellline

一种能内源性表达雌激索受体Animmortalizedadenocarcinomacellthatendogenouslyexpress

BG-1

永生腺癌细胞estrogenreceptor

DMSO二甲基业飒Dimethylsulfoxide

hERa人雌激素受体aHumanestrogenreceptoralpha

2

GB/T35519—2017

表1（续）

缩略语中文全称英文全称

hER/?人雌激素受体PHumanestrogenreceptorbeta

洛斯维帕克研究所研发的一类

RPMI1640Roswellparkmemorialinstitute1640

培养基，培养基代号1640

DNA脱氧核糖核酸deoxyribonucleicacid

3试验原理

3.1基于效能的试验指导原则中试验方法原理

3.1.1雌激素与受体的相互作用调控基因转录，诱导和阻滞细胞的复制，影响细胞增殖、胎儿发育和生

殖功能。干扰正常的雌激素系统会对机体的生殖发育产生不良影响。

3.1.2化学品与特异受体直接或间接作用调节报告基因的转录。转录激活试验广泛用于评估受特定

核受体（如雌激素受体）调控的特定基因表达，用于受雌激素受体调控的雌激素转录激活的检测。雌激

素受体（EstrogenReceptor,ER）至少存在两种亚型，即a和P亚型，由完全不同的基因编码，具有不同

的组织分、配体相对结合力和生物学功能。受体ERa只是对经典的雌激素反应进行调节，目前正在

研发的模型主要是测定与ERa有关的ER活性。试验原理是化学品与配体结合后激活ER,然后受体-

配体复合物结合到脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA）反应元件，转录激活报告基因，使细胞中

标志蛋白表达增加。有两种不同的报告反应:在荧光素酶系统里荧光素酶使荧光素底物转变成生物荧

光产物，用光度计定量检测；利用荧光蛋白和LacZ基因，LacZ基因能编码/?-半乳糖，将无色底物X-gal

（5-漠-4-氯-3"引味仔D-半乳糖昔）转化成蓝色产物，用光度计检测。

3.2试验的使用范围和局限性

3.2.1本方法是体外检测化学品结合ERs引发的转录激活活性，因此试验结果不能直接推演到体内有

复杂信号和调控机制的正常内分泌系统。

3.2.2雌激素受体介导的转录激活是内分泌紊乱的主要机制之一，还有一些其他的内分泌干扰机制，

包括：

——与内分泌系统中其他受体和酶作用；

激素合成；

激素的代谢激活和/或失活；

——靶组织激素的分；

——机体中激素的清除。

3.2.3本方法描述了化学品激活（如激动剂）而不是抑制（如拮抗剂）ER依赖的转录能力。因此，试验

结果为阴性的化学品应在进行了ER结合试验或在检测ER拮抗剂的试验之后，才能得出化学品不能

结合ER的结论。

4试验方法与步骤

4.1方法

本方法是一种适用于由一个或多个雌激素反应元件调控的使用稳定转染/内源性ERa受体和稳定

3

GB/T35519—2017

转染报告基因的方法，但是也适用于其他的雌激素受体如ER"。

4.2对照

应确定参照雌激素和对照物。合适的对照（阴性、溶剂和阳性对照），确认试验是否在同等的试验条

件下进行。

4.3质量控制规程

标准质量控制规程应能确保细胞系稳定传代，无支原体污染及对雌激素反应良好。细胞系应保证

其良好的特性和不受污染（如真菌、酵母菌核病毒）。

4.4实验室操作熟练程度验证

按照本方法检测未知化学品前,每个实验室应能熟练地检测已知的标准品，以确保试验系统良好。

4.5验收标准的测试运行

所有的验收标准应确保试验的有效性。测试的接受与否取决于每个试验的参照雌激素和对照品的

检测结果。参照雌激素的PCd或EC：。应符合选择的试验的验收标准（稳定转染激活试验见附录A,

BGILuc雌激素受体转录激活试验见附录B）.以及所有的阳性和阴性对照在试验中应有正确的分类。

多个实验室参照雌激素Illi线拟合参数平均值的标准差或变异系数可以用于验证实验室间的重复性。还

应符合以下验收标准：

——应有足够的数据以定量评估ER激活作用（效果和效力）；

—参照雌激素的参考浓度的平均反应活度不能小于测试方法中溶剂对照的最小特异倍数（对于

稳定转染激活试验和BGILuc雌激素受体转录激活试验，最小特异倍数为4）,以保证试验的

敏感性；

——化学品浓度应在可溶性范围且不能产生细胞毒性。

注1：PG即所引起的响应水平等于同板的阳性对照物（1nmol/L17价雌二醇）诱导的响应水平工％的受试物浓度。

注2：EC：。即激动剂引起基线（底部）和最大响应（顶部）之间一半时的浓度。

5数据和报告

5.1数据分析

试验数据可用于阳性和阴性反应分类。试验系统的使用应符合验收标准，但是即便符合验收标准

也不能确保试验得到正确的数据。重复试验才是保证数据可靠性的最好方法，如果试验数据一致（如两

次试验都判断化学品为阳性），不用重复第三次。如两次试验结果不一致（如一次判断为阳性，一次为阴

性），或者需更大的把握，则应重复第三次。

5.2数据分析标准

本试验方法的结果还没有统一的分析方法，但是ER激活能力的定性（如阳性/阴性）或定量（如

E4和PC：。）分析应在科学的数据分析方法下进行，在条件允许的情况下，阳性结果应同时依据反应强

度（与溶剂对照和参照雌激素比）和反应浓度（如EC5o,PC5（）.受试物诱导的最大反应水平等）判断。

5.3试验报告

试验报告应包括下列信息：

a）受试物：

4

GB/T35519—2017

——鉴定资料和CA号（如已知）；

——物理性质和纯度；

——与试验实施有关的理化性质；

——受试物的稳定性。

b）溶剂，赋形剂：

——信息描述（特征、供应商及批号）；

选择依据；

——受试物在溶剂/赋形剂中的溶解性和稳定性（如已知）。

C）细胞：

——细胞种类和来源（是否表达ER或转染哪种受体）；

——分子，包括来源；

——选择能保证稳定转染的方法（适用）；

——转染方法与稳定的细胞系是否相关；

——细胞代数（从复苏开始）；

一一细胞复苏时的传代数；

——细胞维持方法。

d）试验条件：

—溶解性；

评估活性的方法；

培养基成分和二氧化碳浓度；

一一受试物浓度；

一一添加的溶媒及受试物体积；

——培养温度和湿度；

——细胞染毒持续时间；

——细胞开始时和处理期间的密度；

——阳性和阴性对照物；

——报告试剂（产品名称、供应商和批号）；

——判断试验结果是阴性、阳性或双向的标准。

e）验收检查：

——每个测试板的诱导效果和根据历史对照判断是否达到试验方法的最低要求；

——阳性对照和参考化学品的lgEC50JgPC5（）和Hill斜率值。

f）结果：

——原始数据和标准化处理后的数据；

——最大诱导水平；

细胞毒性数据；

——最低有效浓度（如有）；

—受试物诱导的最大反应水平,诱导最大反应水平的受试物浓度，PCm和/或PCw值（如适

用）；

剂量-反应关系（如有）；

-统计分析，包括误差和可信度（如标准差、变异系数或95%置信区间）及如何获取这些数

值的描述（如有）。

g）结果讨论。

h）结论。