GB/T 31789-2015 冬生疫霉菌检疫鉴定方法

ICS65.020.01

B16

中华人民共和国国家标准

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GBT317892015

冬生疫霉菌检疫鉴定方法

DetectionandidentificationofPhtohthorahibernalisCarne

yp

2015-07-03发布2015-11-27实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

中国国家标准化管理委员会

/—

GBT317892015

前言

本标准按照/—给出的规则起草。

GBT1.12009

。。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任

本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(/)提出并归口。

SACTC271

:、。

本标准起草单位中国检验检疫科学研究院中华人民共和国厦门出入境检验检疫局

:、、、、。

本标准主要起草人杜洪忠吴品珊王宏毅严进张秋娥

Ⅰ

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GBT317892015

冬生疫霉菌检疫鉴定方法

1范围

本标准规定了冬生疫霉菌的检疫鉴定方法。

、、、

本标准适用于针对冬生疫霉菌寄主的苗木枝条枝叶果实以及夹带土壤和介质中冬生疫霉菌的

鉴定。

2仪器和用具

2.1仪器

、、、(/)、、、、

生物显微镜超净工作台光照培养箱电子天平11000g高压灭菌锅冰箱PCR扩增仪荧光

、、、、。

PCR扩增仪电泳仪凝胶成像仪高速冷冻离心机恒温水浴锅

2.2用具

、、、、、、、、、、、、、

烧杯三角瓶量筒试管培养皿酒精灯镊子剪刀解剖刀接种针载玻片盖玻片塑料研杵

、、、。

移液器移液器吸头离心管液氮罐

、

3试剂材料和培养基

3.1试剂

(),(),(),(

匹马霉素imaricin氨苄青霉素钠盐amicillin利福平钠盐rifamicin五氯硝基苯enta-

pppp

),(),(),(),(),

碳酸钙谷甾醇色氨酸硫氨

chloronitrobenzeneCaCO--sitosteroltrtohanthiamine

3ββypp

(·),()。

氯化钙CaClHO次氯酸钠NaClO

22

琼脂糖,,,,(乙二胺四乙酸四钠盐),,,,,

Tris-HClMClHClEDTANaOHNaOAcKClTrisCTAB

g2

(),,(),(),(),

十六烷基三甲基溴化铵TAE无水乙醇Ethanol三氯甲烷Chloroform异丙醇Isoroanol异

pp

(),,,,,

戊醇IsoamlalcoholSYBRGreenI核酸染料蛋白酶KTaDNA聚合酶dNTPsDNA相对分子

yq

,,

质量标准物引物和实时荧光引物和及探针

PCRPHIB1PHIB2PCRPH-FPH-RTaMan-MGB

q

PH-Pr。

3.2材料

、、()、()、、。

琼脂粉V8汁雪松松针Cedrusdeodara柑橘叶片Citruss.胡萝卜玉米油

pp

3.3培养基

、、,

V8培养基胡萝卜丝培养基CPA选择性培养基PARP-V8和卵孢子培养基具体配方参见附

录B。

4检疫鉴定方法

4.1症状检查

,;,,

重点观察柑橘果实是否有褐色病变叶和小枝是否枯萎杜鹃属植物观察叶片是否有深褐色病斑

1

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GBT317892015

;。,;

或整个叶片和叶柄变褐参见附录A玫瑰受害症状为叶部和小枝枯萎茎基部有深紫色到黑色病斑

其他寄主上为根部腐烂或溃疡。

4.2分离培养和诱集

4.2.1寄主组织分离培养

、、、,

可疑症状的根茎叶果实用流水冲洗表面约15min在病健交界处或变色部位切取边长为5mm×

,,,

5mm的样品灭菌滤纸吸干水分放于选择性培养基PARP-V8上或用0.5%次氯酸钠消毒2min~

,,,。

无菌水冲洗次灭菌滤纸吸干水分放于胡萝卜丝培养基或稀释倍或倍的培养基上

5min3510V8

,,,

培养皿黑暗培养如有真菌菌落出现转到培养基上纯化

16℃~20℃4d~6dV816℃~20℃

黑暗培养。

4.2.2土壤和介质诱集

,、,(),

称取25g土壤或介质碾碎去杂放入灭菌烧杯中加入无菌水将土壤或介质润湿无游离水保

,。

鲜膜封口置于16℃~20℃黑暗放置

,。,

3d~5d后在烧杯中加入灭菌水使水层高4.0cm取雪松松针或柑橘叶片无菌水清洗后漂放在

水面或浸在水中,黑暗放置。

16℃~20℃

,,,,

2d~3d后开始检查取有失绿或变色的松针或叶片无菌水冲洗灭菌滤纸吸干水分放于选择性

,。,

培养基PARP-V8或胡萝卜丝培养基上16℃~20℃黑暗培养如有真菌菌落出现转到V8培养基

上纯化,黑暗培养。

16℃~20℃

4.2.3孢子囊培养

,,

取纯化后菌落边缘菌丝块置于盛有10mL无菌水的培养皿中16℃~20℃黑暗条件下诱发孢子

囊,后观察菌丝块周围孢子囊产生情况。

48h

4.2.4卵孢子培养

,,。

将分离菌转至卵孢子培养基上培养周周观察是否有卵孢子形成

7℃~8℃1~2

4.3分子生物学检测

4.3.1DNA提取

,。。

收集分离到的真菌菌丝采用CTAB法提取核酸参见附录C

4.3.2PCR检测

,。

采用引物和的特异性检测从病菌基因组中扩增到的基因片段

PHIB1PHIB2DNAPCR

特异性引物和的序列分别为和

PHIB1PHIB25'-TCGGGTCTGAGCTAGTAGTCTT-3'5'-CT-

。

TCCACAACCAATTCCATTATGC-3'

():,,/,/

反应体系25L样品DNA1L10×PCR缓冲液2.5L25mmolLMCl2L2.5mmolL

μμμg2μ

,/引物各,/聚合酶,。

dNTPs2L10molL0.5L5ULTaDNA0.2LddHO16.3L

μμμμqμ2μ

反应条件为;,,