GB/T 18646-2018 动物布鲁氏菌病诊断技术

ICS11220

B41.

中华人民共和国国家标准

GB/T18646—2018

代替

GB/T18646—2002

动物布鲁氏菌病诊断技术

Diagnostictechniquesforanimalbrucellosis

2018-02-06发布2018-09-01实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布

中国国家标准化管理委员会

GB/T18646—2018

前言

本标准按照给出的规则起草

GB/T1.1—2009。

本标准代替动物布鲁氏菌病诊断技术本标准与相比

GB/T18646—2002《》。GB/T18646—2002,

主要技术变化如下

:

增加了规范性引用文件见第章

———(2);

增加了缩略语见第章

———(3);

增加了临床诊断方法包括流行特点临床症状和病理变化见和

———,、(4.1、4.24.3);

增加了试管凝集试验中的微量法见

———(4.6.1);

增加了补体结合试验中的微量法并规定了其稀释液的制备溶血素效价的测定补体效价的

———,、、

测定溶血标准比色的制备方法见附录附录附录和附录

、(4.7.1、B、C、DE);

增加了间接酶联免疫吸附试验并规定了酶联免疫吸附试验抗原包被板的制备酶标抗体的制

———,、

备酶联免疫吸附试验用试剂的配制见附录附录和附录

、(4.8、G、HI);

增加了竞争酶联免疫吸附试验并规定了酶联免疫吸附试验抗原包被板的制备酶标抗体的制

———,、

备酶联免疫吸附试验用试剂的配制见附录附录和附录

、(4.9、G、HI);

增加了病原的涂片染色镜检见

———(4.10);

增加了病原的分离培养规范了培养细菌所用的培养基及病料采集需采集的样本名称见

———,(4.11、

附录和附录

JK);

增加了病原的生化特性鉴定方法并规定了不同生化试验的培养基制备见附

———,(4.12.1~4.12.5、

录和附录

LM);

增加了病原的因子血清试验鉴定方法以表格形式列出单因子血清试验结果见和

———,(4.12.6

表

4);

增加了病原的噬菌体溶解试验鉴定方法以表格形式列出各菌种噬菌体溶解试验结果见

———,(4.12.7

和表

5);

增加了布鲁氏菌种的扩增图谱鉴定技术并规范了其对引物序列以图谱形式列出布

———PCR,8,

鲁氏菌种个种的扩增条带和个疫苗株的扩增条带见附录和图

103(4.13、N1);

增加了警告内容对于剖检采样及实验室开展相关病原活动部分及实验室接触有毒物质部分

———,、

给以警告

。

本标准由中华人民共和国农业部提出

。

本标准由全国动物卫生标准化技术委员会归口

(SAC/TC181)。

本标准起草单位辽宁省动物疫病预防控制中心辽宁省动物医学研究院中国动物卫生与流行病

:()、

学中心中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

、。

本标准主要起草人李璐赵晓彤曹东范伟兴段亚良田莉莉步志高顾贵波杨作丰赵凤菊

:、、、、、、、、、、

谷志大狄栋栋闫明媚张慧魏澍郑洪玲张喜悦胡森

、、、、、、、。

Ⅰ

GB/T18646—2018

引言

布鲁氏菌病简称布病是由布鲁氏菌属细菌感染导致人兽共患的传染病在全世界范围内严重威

(),

胁人类健康并影响畜牧业发展布鲁氏菌属包括羊种布鲁氏菌B.melitensis牛种布鲁氏菌B.abor-

。()、(

tus猪种布鲁氏菌Bs.uis绵羊附睾种布鲁氏菌Bo.vis犬种布鲁氏菌Bc.anis沙林鼠种布鲁氏

)、()、()、()、

菌B.neotomae鲸种布鲁氏菌B.ceti鳍种布鲁氏菌B.inniedialis和田鼠种布鲁氏菌

()、()、(pp)

B.microti及新报道的Bi.noinata其中动物布病主要是由羊种布鲁氏菌牛种布鲁氏菌和猪种布

()p,、

鲁氏菌感染羊牛和猪等动物呈急性或慢性经过是人布病的主要传染来源其临床主要特征是生殖器

、,。

官和胎膜发炎母畜流产乳腺炎不育和各种组织如睾丸关节的炎症世界动物卫生组织

,、、(、)。[World

英法将布病列为法定报告

OrganizationforAnimalHealth(),OfficeIntentionaldesEpizootic(),OIE]

的传染病我国一二三类动物疫病病种名录规定布病为多种动物共患的二类动物疫病

,《、、》。

本标准参考了陆生动物诊断试验和疫苗手册转化了其相关的布病诊断方法并引入到本标

OIE《》,

准中本标准修订了原有血清学诊断方法引入了诊断方法建立了我国微量凝集反应补充了

。,ELISA,,

病原学和分子生物学诊断方法不仅适用于我国布鲁氏菌病诊断需求也达到了国际诊断水平

,,。

Ⅱ

GB/T18646—2018

动物布鲁氏菌病诊断技术

1范围

本标准规定了动物布鲁氏菌病的临床诊断血清学和病原学诊断的技术方法操作程序和判定

、、

标准

。

本标准规定的流行特点临床症状病理变化适用于动物布鲁氏菌病的临床诊断

、、。

虎红平板凝集试验和间接酶联免疫吸附试验适用于动物布鲁氏菌病的初筛试验

,;

乳牛全乳环状试验适用于泌乳母牛布鲁氏菌病的初筛试验

,;

试管凝集试验补体结合试验和竞争酶联免疫吸附试验适用于牛种羊种和猪种布鲁氏菌病的血清

、、

学确诊

;

病原的显微镜检查分离培养适用于布鲁氏菌病的病原学初步诊断病原的鉴定和试验适用

、;PCR

于动物布鲁氏菌病的病原学确诊

。

本标准规定的乳牛全乳环状试验不适用于检测患乳房炎及其他乳房疾病母牛的乳初乳脱脂乳

,、、

和煮沸过的乳也不适用于腐败变酸和冻结过的乳

,、。

本标准规定的虎红平板凝集试验试管凝集试验和补体结合试验不适用于犬种和绵羊附睾种布鲁

、,

氏菌的检测

。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文

。,

件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件

。,()。

出入境动物检疫采样

GB/T18088

实验室生物安全通用要求

GB19489—2008

3缩略语

下列缩略语适用于本文件

。

世界动物卫生组织英

OIE(WorldOrganizationforAnimalHealth(),OfficeIntentionaldesEpi-

法

zootic())

虎红平板凝集试验

RBT(RoseBengalTest)

乳牛全乳环状试验

MRT(MilkRingTest)

试管凝集试验

SAT(SerumAgglutinationTest)

补体结合试验

CFT(ComplementFixationTest)

间接酶联免疫吸附试验

iELISA(IndirectEnzymeLinkedImmunosorbentAssay)

竞争酶联免疫吸附试验

cELISA(CompetitiveEnzymeLinkedImmunosorbentAssay)

聚合酶链式反应

PCR(PolymeraseChainReaction)

脱氧核糖核酸

DNA(Deoxyribonucleicacid)

脱氧核苷三磷酸

dNTPs(Deoxy-RibonucleosideTriphosphate)

三羟甲基氨基甲烷硼酸乙二胺四乙酸缓冲液

TBE(TrisBoricAcidEDTA)

1

GB/T18646—2018

辣根过氧化物酶

HRP(HorseradishPeroxidase)

4诊断方法

41流行特点

.

多种动物对布鲁氏菌易感羊牛猪的易感性最强母畜比公畜易感成年畜比幼年畜易感动物

,、、。,。

的易感性随着性成熟年龄接近而增高在母畜中第一次妊娠母畜发病较多

,,。

患病和带菌动物是主要传染源尤其是感染的妊娠母畜在流产或分娩时将大量的布鲁氏菌随着胎

,,

儿胎水和胎衣排出流产后的阴道分泌物和乳汁中都含有布鲁氏菌

、,。

布鲁氏菌病的传播途径主要是消化道也可通过皮肤黏膜交配等感染蜱的叮咬可传播本病

,、、,。

布鲁氏菌病呈现明显的接触传播特征通过直接接触或间接接触均可造成传播在牧区或农牧区多

,,

发疾病的发生不具有明显的季节性在有感染的群体内呈扩散传播特点一般为散发羊种布鲁氏菌

,,。,

病可呈地方流行性发生

。

42临床症状

.

潜伏期一般为

14d~180d。

显著症状是妊娠母畜发生流产流产后可能发生胎衣滞留和子宫内膜炎从阴道流出污秽不洁恶

,,、

臭的分泌物新发病的畜群流产较多老疫区畜群发生流产的较少但发生子宫内膜炎乳房炎关节

。;,、、

炎局部脓肿胎衣滞留久配不孕的较多公畜往往发生睾丸炎附睾炎或关节炎

、、、。、。

43病理变化

.

警示———对本病剖检采样过程当中应当防止病原微生物扩散和感染

。

主要病变为妊娠或流产母畜子宫内膜和胎衣的炎性浸润渗出出血及坏死有的可见关节炎胎

、、,。

儿主要呈败血症病变浆膜和黏膜有出血点和出血斑皮下结缔组织发生浆液性出血性炎症

,,、。

组织学检查可见脾淋巴结肝肾等器官形成特征性肉芽肿

、、、。

44虎红平板凝集试验RBT

.()

441器材

..

微量移液器灭菌移液器吸头牙签或混匀棒计时器洁净的玻璃板其上划分成2的方格

,、,,(4cm)。

442试剂

..

商品化的布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原布鲁氏菌标准阳性血清和布鲁氏菌标准阴性血清

、。

443操作方法

..

4431按常规方法采集和分离受检血清

...。

4432将受检血清布鲁氏菌标准阴阳性血清和抗原从冰箱取出平衡至室温

...、、。

4433涡旋混匀血清和抗原分别吸取的血清和抗原加于玻璃板2方格内的两侧

...,25μL4cm。

4434用灭菌牙签或混匀棒快速混匀血清和抗原涂成直径的圆形混匀后在自然光下

...,2cm,4min,

观察

。

4435试验应设标准阴阳性血清对照

...、。

444结果判定

..

4441在标准阴性血清不出现凝集标准阳性血清出现凝集时试验成立方可对受检血清进行判定

...、,,。

2

GB/T18646—2018

4442出现肉眼可见凝集现象者判定为阳性无凝集现象且反应混合液呈均匀粉红色者判定为

...(+),

阴性

(-)。

45乳牛全乳环状试验MRT

.()

451器材

..

微量移液器灭菌移液器吸头内径为的灭菌试管

,,1cm。

452试剂

..

商品化布鲁氏菌全乳环状试验抗原

。

453乳样

..

受检乳样应为新鲜的全乳或混合奶采乳样时应将乳牛的乳房用温水洗净擦干然后将乳汁前

,;、,(

三把乳不作为检测用挤入洁净的器皿中采集的乳样夏季时应于当日内检测

);。

454操作方法

..

4541将乳样和布鲁氏菌全乳环状试验抗原平衡至室温

...。

4542取乳样加于灭菌凝集试管内

...1000μL,。

4543取充分振荡混合均匀的布鲁氏菌全乳环状试验抗原加入乳样中充分混匀

...50μL。

4544置水浴中孵育

...37℃~38℃60min。

4545孵育后取出试管勿使振荡立即进行判定

...,。

455结果判定

..

结果判定如下

:

强阳性反应乳柱上层乳脂形成明显红色的环带乳柱白色临界分明

a)(+++),,,;

阳性反应乳脂层的环带呈红色但不显著乳柱略带颜色

b)(++),,,;

弱阳性反应乳脂层的环带颜色较浅但比乳柱颜色略深

c)(+),,;

疑似反应乳脂层的环带颜色不明显与乳柱分界不清乳柱不褪色

d)(±),,,;

阴性反应乳柱上层无任何变化乳柱颜色均匀

e)(-),,。

46试管凝集试验SAT

.()

461微量法

..

4611器材

...

孔型聚苯乙烯板微量移液器灭菌移液器吸头塑料薄膜湿盒振荡器适宜的稀释用器皿

96U、、、、、、

及温箱

(37℃±1℃)。

4612试剂

...

商品化试管凝集试验抗原布鲁氏菌标准阳性血清布鲁氏菌标准阴性血清稀释液为含石炭

、、、0.5%

酸的生理盐水用于检验牛血清时稀释血清和抗原或含石炭酸的氯化钠溶液用于检验羊

()0.5%10%(

血清时稀释血清和抗原

)。

4613操作方法

...

46131按常规方法采集和分离受检血清

....。

3

GB/T18646—2018

46132受检血清的稀释

....:

以羊血清为例每份血清用个连续的型孔

a),4U;

在聚苯乙烯反应板的第孔加稀释液

b)1184μL;

第孔孔各加入稀释液

c)2~4100μL;

用微量移液器取受检血清加入第孔并混匀

d)16μL;1,;

从第孔吸取混合液加入第孔充分混匀如此倍比稀释至第孔从第孔弃去混

e)1100μL2,4,4

合液

100μL;

稀释完毕从第至第孔的血清稀释度分别为和

f),141∶12.5、1∶25、1∶501∶100;

牛血清稀释法与上述基本一致差异是第孔加稀释液和受检血清其稀释度分

g),1192μL8μL,

别为和

1∶25、1∶50、1∶1001∶200。

46133分别取按说明书要求稀释的抗原加入上述各孔稀释好的血清中并振荡混匀羊的

....100μL,,

血清稀释度则依次变为和牛的血清稀释度则依次变为

1∶25、1∶50、1∶1001∶200,1∶50、1∶100、

和

1∶2001∶400。

46134将加完样的聚苯乙烯反应板各孔用塑料薄膜严密封盖后放湿盒内置温箱孵

....,(37℃±1℃)

育取出检查并记录结果

18h~24h,。

46135每次试验均应设阳性血清对照阴性血清对照和抗原对照即

....、,:

阴性血清对照冻干阴性血清按说明书稀释到规定容量后对照试验中稀释和加抗原的方法与

a):,

受检血清相同

;

阳性血清对照冻干阳性血清按说明书稀释到规定容量后对照试验中稀释和加抗原的方法与

b):,

受检血清相同

;

抗原对照抗原按说明书稀释到规定容量取再加稀释液观察抗原是否有自

c):,100μL,100μL,

凝现象

。

4614结果判定及处理

...

46141凝集反应程度

....

凝集反应程度分为个等级分别记为按以下说明判定

5,“++++”“+++”“++”“+”“-”,:

菌体完全凝集孔孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底

a)++++:,1~4;

菌体几乎完全凝集孔孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底第孔孔底呈现白色

b)+++:,1~3,4

点状

;

菌体凝集显著孔孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底孔孔孔底呈现白色点状

c)++:,1~2,3~4;

凝集物有沉淀第孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底孔孔孔底呈现白色点状

d)+:,1,2~4;

无凝集孔孔孔底均呈现白色点状

e)-:,1~4。

46142结果判定

....

当阳性血清出现完全凝集