DB34/T 2072-2014 杂交棉花及亲本真实性鉴定DNA分析方法

ICS65.020

B32

DB34

安徽省地方标准

DB34/T2072—2014

杂交棉花及亲本真实性鉴定DNA分析方法

IdentificationofgenuinenessofhybridcottonanditsparentsusingDNAanalysis

method

2014-02-17发布2014-03-17实施

安徽省质量技术监督局发布

DB34/T2072—2014

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由安徽省质量技术监督局提出。

本标准归口单位：安徽省农业标准化技术委员会。

本标准起草单位：安徽省农业科学院水稻研究所、安徽省农业科学院棉花研究所。

本标准主要起草人：张小娟、陆徐忠、杨剑波、路曦结、何团结、郑曙峰、李莉、倪金龙。

I

DB34/T2072—2014

杂交棉花及亲本真实性鉴定DNA分析方法

1范围

本标准规定了杂交棉花及亲本真实性鉴定DNA分析方法的术语和定义、原理、试剂与溶液、主要

仪器、操作步骤、结果判定。

本标准适用于陆地棉品种真实性鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验

GB4407.1经济作物种子第1部分:纤维类

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

品种真实性varietalgenuineness

供检品种与文件记录(如标签等)是否相符。本标准中指品种间在DNA分子标记带型上的一致性。

3.2

标准样品standardsample

经权威机构认定认证的代表已知品种特征特性的样品，对有性繁殖作物而言，一般为种子。

3.3

带型patterns

某核心引物扩增特定单株DNA得到的条带类型。

4原理

根据SSR序列两端保守的单拷贝序列设计特异引物，利用PCR技术扩增和电泳分析，获得样品各

单株的SSR电泳带型。将受检样品与标准样品就单株间的带型逐一进行差异比较和判读分析，进行棉

花品种的真实性鉴定。

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DB34/T2072—2014

5试剂与溶液

5.1仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水。

5.2β-巯基乙醇

5.3异丙醇

5.4剥离硅烷

5.5四甲基乙二胺（TEMED）

5.6TaqDNA聚合酶

5.7PCR反应缓冲液（10×Buffer）

5.825mmol/L氯化镁溶液（MgCl2）

5.91mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（Tris-Hcl）：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）

溶解于800mL水中，用盐酸（HCl）调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）

条件下灭菌20min，4℃储存。

5.1010mol/L氢氧化钠溶液（NaOH）：在160mL水中加入80.0g氢氧化钠（NaOH），溶解后，

冷却至室温，再加水定容到200mL。

5.110.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（EDTA-Na2）（pH8.0）：称取187.6g乙二铵四乙酸二钠

（EDTA-Na2）加入800mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液，加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧

化钠溶液调pH值至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min，4℃储

存。

5.12DNA抽提液：分别称取69.3g葡萄糖，20.0g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），1.0g二乙基二硫代

氨基甲酸（DIECA）溶于500mL水中，然后分别加入100mL1mol/L的Tris-HCl溶液、10mL0.5

mol/L的EDTA-Na2溶液（pH8.0），定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min，4

℃储存。

5.13DNA裂解液：分别称取81.7g氯化钠（NaCl），20.0g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），20.0g十

六烷基三甲基溴化铵（CTAB），1.0g二乙基二硫代氨基甲酸（DIECA）溶于500mL水中，然后分别

加入100mL1mol/L的Tris-Hcl溶液，4mL0.5mol/L的EDTA-Na2溶液（pH8.0），定容到1000

mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min，4℃储存。

5.14苯酚+氯仿+异戊醇混合液：体积比为25+24+1。

5.15氯仿+异戊醇混合液：体积比为24+1。

5.1670％乙醇：量取70mL无水乙醇，加水定容至100mL。

5.17SSR引物工作液：引物序列参见附录A，将引物配制成终浓度均为10μmol/L的上、下游引物

工作液。

5.18dNTPs混合溶液：浓度为2.5mmol/L的dNTPs混合溶液。

5.195×三羟甲基氨基甲烷/硼酸电泳缓冲液（5×TBE）：分别称取50.0g三羟甲基氨基甲烷，27.5

g硼酸溶于500mL水中，加入10mlL0.5mol/LEDTA-Na2（pH8.0），定容至1000mL，4℃储存。

5.20加样缓冲液：在98mL去离子甲酰胺中加入250mg溴酚蓝（BromophenolBlue）、250mg二

甲苯氰（XyleneCyanoleFF）、2mL0.5mol/LEDTA，溶解混匀，常温保存。

5.21亲和硅烷工作液：在1mL无水乙醇中加入5μL亲和硅烷原液，混匀。

5.226％变性聚丙烯酰胺溶液：称取57.0g丙烯酰胺，3.0g甲叉双丙烯酰胺，420.0g尿素溶于

200mL水中，加入200mL5×TBE，室温充分溶解后，定容至1000mL，4℃储存。丙烯酰胺具神经毒

性，配制时应注意防护。

5.2310％过硫酸铵溶液：称取10.0g过硫酸铵溶于100mL水中，4℃储存。

5.241％硫代硫酸钠：称取1.0g硫代硫酸钠，溶于100mL水中，室温储存。

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DB34/T2072—2014

5.25固定液：在89.5mL水中加入10mL无水乙醇，0.5mL冰醋酸，根据胶板数量调整固定液的

量，现用现配。

5.26染色液：在100mL水中加入0.2g硝酸银（AgNO3），根据胶板数量调整染色液的量，现用

现配。

5.27显影液：在100mL水中加入1.5gNaOH和0.4mL甲醛(37％)，根据胶板数量调整显影液

的量，现用现配。

6主要仪器

6.1PCR扩增仪。

6.2电泳检测系统：垂直电泳系统。

6.3单道微量移液器：2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL。

6.4多道微量移液器：8道或12道，10μL、100μL。

6.5酸度计：精度±0.01pH。

6.6电子天平：可读性为百分之一、万分之一。

6.7台式高速冷冻离心机：最大离心力≥10,000g，温控范围-10℃～40℃。

6.8胶片观察灯。

7操作步骤

7.1试样制备

受检样品和标准样品可为棉花的种子、幼嫩叶片等。样品纯度应符合GB4407.1的规定，种子扦

样按GB/T3543.2规定执行，种子发芽按GB/T3543.4规定执行（幼苗长度达3cm左右用于制备PCR

模板）。

以受检样品所标注品种的标准样品作为对照，同时检测受检样品和标准样品。

7.2PCR模板制备

分别从受检样品和标准样品中随机抽取12粒种子或单株，利用CTAB法（见附录B）分单株（或

单粒种子）制备PCR模板。

7.3PCR扩增

利用39对核心引物（见附录A）逐一对受检样品和标准样品各单株DNA进行扩增。

7.3.1PCR扩增反应体系

在PCR反应管中按表1依次加入反应试剂，混匀。

表1PCR扩增反应体系

试剂终浓度体积

一级水—*

10×PCR缓冲液1×2.0µL

25mmol/LMgCl2溶液2.5mmol/L2.0µL

dNTPs混合溶液（各2.5mmol/L）各0.25mmol/L2.0µL

3

DB34/T2072—2014

表1（续）

试剂终浓度体积

10µmol/L上游引物0.2µmol/L0.4µL

10µmol/L下游引物0.2µmol/L0.4µL

TaqDNA聚合酶1.0U—*

PCR模板2.0µL

总体积20.0µL

注：“*”表示体积不确定。如果PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液；根据Taq酶的浓度确定其体积，并

相应调整水的体积，使反应体系总体积达到20.0µL。

7.3.2PCR扩增反应程序

反应程序为：95℃变性3