GB/T 36820-2018 甘蔗条纹花叶病毒实时荧光反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法

ICS65.020.01

B16

国

中华人民共和国国家标准

GB/T36820-2018

甘震条纹花叶病毒实时荧光反转录聚合酶

链式反应（RT-PCR）检测方法

DetectionmethodofSugαrcanestreαkmosαicvirusbyreal-timereverse

transcriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR)

2018-09-17发布2019-04-01实施

国家市场监督管理总局峪非

中国国家标准化管理委员会0(..'I(J

GB/T36820-2018

目u昌

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由全同植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出井归口。

本标准起草单位：福建农林大学同家甘煎t程技术研究中心、农业部甘服及制品质量监督检验测试

中心、农业部福建廿班生物学与遗传育种重点实验室。

本标准主要起草人：高三基、黄美婷、傅华英、孙生f：、张慧丽、王锦达、陈如凯。

I

GB/T36820-2018

甘蕉条纹花叶病毒实时荧光反转录聚合酶

链式反应（RT-PCR）检测方法

1范围

本标准规定了甘煎条纹花叶病毒（Sugaγα111P写lreahmοsC1itvirus）实时荧光反转录聚合陪链式反

应（RT-PCR）检测方法的仪器与设备、试剂与材料、样品的采集与前处理、检测以及结果判断与表述等。

本标准适用于可能带有it煎条纹花叶病毒的吊体寄主植物的快速检测、诊断。

2缩略i吾

下列缩略语适用于本文件。

CP：外壳蛋白（coatprotein)

Ct值：实时荧光PCR反应中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数（cycle

threshold)

cDNA：与RNA链互补的单链DNA(complementaryDNA)

ExTaqHS酶：热启动DNA聚合鸭山otstartDNApolymerase)

FAM,6－援基荧光素（6-carboxy-fluorcscein)

PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction)

RNA：核糖核酸（rihonucleicacid)

RT-PCR：反转录聚合隅链式反应（reversetranscriptionpolym巳rasechainreaction)

SCSMV:Itl［条纹花叶病毒（SuJ.;(ffC(/1/Pstrpa企mο川icvir川）

TAMRA,6－援基匹i甲基罗丹明（6-carboxytctramcthyIrhodamine)

Tip：吸头

3方法原理

根据甘煎条纹花叶病毒CP基因序列设计一对仅在该病毒CP基因间保守的特异性引物和一条特

异性的荧光双标记水解型寡核背酸探钊（TaqMan探告｜）。首先利用反转录隅将病毒RNA反转成

cDNA，再以cDNA为模板在同一反应管内连续进行实时荧光PCR扩增反应，水解型寡核背酸探针

(TaqMan探针’）的荧光信号强度伴随着目标序列PCR扩增产物的增加呈正比关系，通过收集PCR扩

增过程的荧光信号值，即可判断试样是再带有目标序列。1干荒条纹花叶病信息参见附录A。

4仪器与设备

4.1实时荧光PCR检测仪：激发／检测波长范围350nm~750nm；可用荧光染料（SYERGreenI)和水

解型寡核二日＝酸探针（TaqMan探钊）;fl·阵泪速度注2.0。'C/s；均一性＋／一0.5℃；准确性十／－0.3℃；泪

度范围4。C～100℃。

4.2核酸蛋向分析仪或紫外分光光度计。

4.3电子天平：感量0.01g。

GB/T36820-2018

4.4高速台式冷冻离心机：离心力12OOOg以上。

4.5微量加样器：0.1,uL~2.5/..tL、0.5µL~10µL、2µL~20µL、10µL~100µL、20,uL~200µL、

50µL~1000,uL。

4.6元核酸雨（Nuclease）的1.5mL、2.0mL离心管，PCR反应管、带滤芯Tip头、实时荧光PCR反

应管。

4.7恒温水恪锅。

4.8鼓风干燥箱。

4.9冰箱：2℃～8℃、－20℃、－80℃。

4.10生物安全柜。

4.11采样T具：砍刀、剪刀、慑子、带槽钻子。

5试剂与材料

5.1试剂

除非另有规定外，在分析中仅使用分析纯试剂，实验用水符合GB/T6682的二级水指标，其中涉及

PCR的用水要求达到一级水指标。

5.1.1氯仿。

5.1.2异丙醇。

5.1.3元水乙醇。

5.1.4元核酸陌（Nucl巳ase）水。

5.1.5裂解液：主要成分为异硫氨酸肌和苯酣，为RNA提取试剂。

5.1.675%乙醇。

5.1.7定量荧光PCR检测寻｜物

5＇刁｜物：5’－CGGGAAACCCATAATACCAC-3＇。

3＇－引物：5’－GTCGATTTCTGCTGGTGAGA-3'"

扩增片段大小为130bpo

5.1.8水解型寡核轩酸探制（TaqMan探针）

51-FAM-TGCTGCATTGATTTCGT