LY/T 3107-2019 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程

ICS65.020.20

B61

LY

中华人民共和国林业行业标准

LY/T3107—2019

柳树品种微卫星标记鉴别技术规程

TechnicalregulationforwillowvarietiesidentificationbySSRmarkers

（发布稿）

2019-10-23发布2020-04-01实施

国家林业和草原局发布

LY/T3107—2019

前言

本标准按照GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。

本标准由全国林木种子标准化技术委员会（SAC/TC115）提出并归口。

本标准主要起草单位：南京林业大学。

本标准参加起草单位：江苏省林业科学研究院；山东省林业科学研究院。

本标准主要起草人：李淑娴、戴晓港、尹佟明、陈赢男、刘德玺、何旭东。

I

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柳树品种微卫星标记鉴别技术规程

范围

本标准规定了以柳属(Salix)植物DNA为材料，利用微卫星标记(microsatellite)对国家和省审(认)定

的柳树品种进行分子鉴定的规范化操作技术。

本标准适用于附录A中所列柳树品种的鉴别。

2术语和定义

2.1微卫星标记microsatellite

微卫星标记，又被称为短串联重复序列(shorttandemrepeats,STRs)或简单重复序列(simplesequence

repeats，简称SSR)，是指基因组中由2～6个核苷酸组成的DNA串联重复序列。

2.2基因型频率genotypefrequency

基因型频率指不同基因型在全部个体中所占的比率，全部基因型频率的总和为1或100%。

3操作程序

3.1取样和保存

取柳树幼嫩叶片5片～10片，用干燥硅胶密封保存，用于DNA提取。

3.2DNA提取所需试剂

a)1MTris：称取12.11gTris溶解到80mL超纯水中，调节pH=8.0，定容到100mL。

b)0.5MEDTA：称取18.61gEDTA溶解到80mL超纯水中，调节pH=8.0，定容到100mL。

c)5M氯化钠：称取23.38g氯化钠溶解到80mL超纯水中，定容到100mL。

d)5M醋酸钾：称取25.54g醋酸钾，200mL超纯水溶解后定容到250mL。

e)2%SDS：称取1.0g十二烷基硫酸钠(SDS)，40mL超纯水溶解后定容到50mL。

f)10%CTAB：称取10gCTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶解到80mL超纯水中，定容到100mL。

g)氯仿异戊醇：240mL氯仿，10mL异戊醇混合。

h)70%乙醇：70mL乙醇，加入30mL超纯水。

i)CTAB裂解液：1mL1MTris(pH=8.0)，4mL0.5MEDTA(pH=8.0)，28mL5M氯化钠，10mL10%

CTAB，5g聚乙烯吡咯烷酮，定容到100mL。

j)TBE缓冲液(10×)：称取108gTris碱和55g硼酸，加入40mL0.5MEDTA溶液（pH=8.0），用

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800mL双蒸水溶解后定容到1L，高温灭菌。

3.3DNA提取

DNA提取采用改良的CTAB法：

a)向2mL离心管中加入400µLCTAB裂解液，10µL的10mg/mLRnase，2µLβ-巯基乙醇。

b)取柳树叶片3-5片，放入研钵中加入液氮充分研磨，将研磨后的样品转入3.2.1的离心管中，

涡旋混匀后，65℃保温10min，再加入400µL2%SDS，涡旋混匀，65℃保温10min。

c)向3.2.2的离心管中加入130µL5M醋酸钾，涡旋混匀，将离心管插入冰中保存10min。

d)加入800µL氯仿异戊醇溶液(氯仿:异戊醇=24:1)，涡旋混匀后，12000rpm离心5min。

e)将上清液转移到新的2mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，颠倒离心管8-10次，-20℃冻

存20min。

f)取出离心管，12000rpm离心5min，去除上清液。

g)加入500µL的70%乙醇，12000rpm离心2min，去除上清液。

h)重复3.2.7步骤一次。

i)加入500µL无水乙醇，12000rpm离心5min，去除上清液，离心管开盖室温放置30min。

j)加入100µLTE缓冲液，37℃保存5min，涡旋混匀获得DNA，将样品放在-80℃长期保存。

3.4DNA定量及质量检测

a)取2µLDNA用微量核酸蛋白检测仪检测，直接读出DNA浓度和A260/280的比值。

b)根据上述测定浓度，取200ngDNA，加入2µL溴酚蓝，在1%的琼脂糖凝胶上电泳，加入5000

bpmarker作对照，稳压100V，电泳缓冲液为1×TBE，电泳结束后用凝胶成像系统记录拍照。

c)根据微量核酸蛋白检测仪的定量结果，将样品稀释成20ng/µL，在-20℃下保存备用。

3.5目的片段PCR扩增

3.5.116对SSR引物及序列见附录B。

3.5.2目的片段扩增反应体系为15µL，具体试剂用量见表1。

表1PCR扩增反应体系

试剂浓度所需体积(µL)

2+

PCRbuffer10×PCRbuffer(MgPlus)1.5

Taq酶5U/µL0.2

ForwardPrimer5mM1

ReverePrimer5mM1

DNA20ng/µL2

dNTP5mM0.3

dUTP250nM1

2

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HO6.8

2

3.5.3PCR扩增反应

将配制的扩增体系加入到8连管或96孔PCR板中，盖上管盖后涡旋混匀，在3000rpm下离心5s，

放入PCR仪中扩增，扩增程序为：

1)94℃变性4min；

2)94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；

3)72℃延伸10min，15℃保存。

3.6目的片段检测

3.6.1PCR产物变性

PCR产物用双蒸水稀释10-15倍，取1µL稀释产物加入到9µL的Loadingbuffer(91%超纯甲酰胺，

9%内标Genescan500Rox)后混匀；在PCR仪上运行变性程序：95℃变性5min，迅速放冰上冷却。

3.6.2PCR扩增产物检测

PCR产物检测采用ABIPRISM3130xl分析系统。从数据采集软件中创建一个片段分析程序，选择

片段分析模式以及光谱校正所用试剂盒类型。创建一个自动分析模板，填写分析样品名称，选择样品类

型、内标类型、分析方法等。将变性的产物转入96孔PCR板，盖上仪器自带的PCR板盖，放入仪器

中。在软件中将PCR板链接到仪器，点击开始进行基因型分型。

3.6.3PCR扩增产物条带分析

采用基因型分析软件打开基因型分型的结果，根据内参大小直接读出每个样品目的片段的大小。

4送检样品分析

送检样品分析程序为：

a)随机选取附录B.1中的一对SSR引物，对待检样品进行PCR扩增。

b)将待检样品扩增得到的条带和附录C.1-C.2中对应引物的标准谱带相比较。

c)如果所有扩增条带和附录C.1-C.2中对应引物某一品种的标准谱带完全相同，即判定为相同品

种；如果扩增条带和其中几个品种的条带完全相同，则增加一对引物进行检测，直至检测到唯

一匹配的品种。

d)如果待检样品所有扩增条带有一个以上位点与标准谱带不同，即判定为不同品种。

e)根据基因型频率判定所鉴定品种真实性的准确率，见附录D。

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附录A

（资料性附录）

本标准适用鉴定的柳树品种表

表A.1本标准适用鉴定的柳树品种

序号品种中文名拉丁名

1苏柳172SalixjiangsuensisCL‘J172’

2苏柳485S.jiangsuensisCL‘485’

3苏柳52-2S.jiangsuensisCL‘52-2’

4苏柳795S.jiangsuensisCL‘J795’

5苏柳799S.jiangsuensisCL‘J799’

6苏柳J932S.jiangsuensisCL‘J932’

7簸杞柳JW9-6S.integra×S.suchowensis‘JW9-6’

8簸杞柳JW8-26S.suchowensis×S.integra‘JW8-26’

9“旱沙王”北沙柳S.psammophila‘Hanshawang’

10银芽柳J1037S.agyrobractealis‘J1037’

11银芽柳J1050S.agyrobractealis‘J1050’

12银芽柳J1055S.agyrobractealis‘J1055’

13银芽柳J887S.agyrobractealis‘J887’

14金丝垂柳J1010S.aureo-pendula‘J1010’

15金丝垂柳J1011S.aureo-pendula‘J1011’

16花叶柳S.integravar.‘HakuroNishiki’

17渤海柳1号S.matsudanaKoidz‘Bohailiu-1’

18渤海柳2号S.matsudanaKoidz‘Bohailiu-2’

19渤海柳3号S.matsudanaKoidz‘Bohailiu-3’

20渤海柳4号S.matsudanaKoidz‘Bohailiu-4’

21旱柳S.matsudanaKoidz

22沙柳S.psammophila

23黄柳S.gordejeviiChangetSkV.

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附录B

（规范性附录）

柳树品种鉴别16对SSR引物序列

表B.1柳树品种鉴别的16对SSR引物

序号引物名称引物正向序列(5’-3’)引物反向序列(5’-3’)

1W254-1AACATTCTGCTTCTTCCTTTAACCTCCATTACCATCCATA

2W46-460AAGCAAGCAAAAGTCAAGAGAGTATGCCAAGCAAGAAGAA

3W64-41TCAGAGCCTGGTTCATAAACAAATGCCAGAGCTAAA

4W64-65GCATACTTGGGCGTTGATTGACTTGGGTTGGGTTTT

5W64-255GTCTGAACCCTCATCTATCTGGAATCCATAATACAC

6W64-272TCACTTGCCGCCCTTCTTTGACGCCGCTGTAACCAC

7W64-286AAAGAATACATTTTAGGTGGATTTCAAGGTTCAATCAAGTTA

8W64-293GCAAAAGCCAAAAGGAGAAACCAGCAGAGGA