DB34/T 3653-2020 番鸭胚垂直传播病毒(RT-)PCR 检测技术规范

ICS65.020.30

B41

DB34

安徽省地方标准

DB34/T3653—2020

番鸭胚垂直传播病毒(RT-)PCR检测

技术规范

Technicalregulationfordetectionofverticaltransmissionvirusesby(RT-)PCRfrom

MuscovyDuckembryos

文稿版次选择

2020-06-22发布2020-07-22实施

安徽省市场监督管理局发布

DB34/T3653—2020

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由安庆永强农业科技股份有限公司提出。

本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：安庆永强农业科技股份有限公司、福建省农业科学院畜牧兽医研究所、利辛县绿

墅养殖专业合作社、安徽黄氏番鸭食品有限公司、阜阳市农业科学院。

本标准主要起草人：刘荣昌、刘友生、蒋晓璐、汪敏、赵巧珍、傅秋玲、黄瑜、黄永强、万春和、

郭大伟、傅光华、施少华、程龙飞。

I

DB34/T3653—2020

番鸭胚垂直传播病毒(RT-)PCR检测技术规范

1范围

本标准规定了番鸭胚垂直传播病毒（RT-）PCR检测技术的术语与定义、仪器与设备、试剂和材料、

操作步骤和结果判定。

本标准适用于番鸭胚垂直传播病毒的（RT-）PCR检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

《禽流感防治技术规范》（农医发[2007]12号）

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

番鸭胚垂直传播病毒VerticaltransmissionvirusinMuscovyduckembryo

可以通过番鸭胚垂直传播的病毒统称，包括鸭甲肝病毒1型（DuckHepatitisVirustype1,

DHAV-1）、鸭甲肝病毒3型（DuckHepatitisVirustype3,DHAV-3）、番鸭细小病毒（MuscovyDuck

Parvovirus,MDPV）、鹅细小病毒（GooseParvovirus,GPV）、番鸭呼肠孤病毒（MuscovyDuckReovirus,

MDRV）、新型番鸭呼肠孤病毒（NovelMuscovyDuckReovirus,N-MDRV）、H9亚型禽流感病毒（H9subtype

ofAvianInfluenzaVirus,H9-AIV）。

4仪器与设备

4.1PCR扩增仪。

4.2台式低温高速离心机，温控范围：-4℃～25℃。

4.3电泳仪，电压范围：60～120V。

4.4紫外凝胶成像系统。

4.5组织匀浆器。

4.6微波炉。

4.7水浴锅，温控范围：37℃～100℃。

4.8微量移液器，可调控量程：0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL。

1

DB34/T3653—2020

5试剂和材料

5.110％的十二烷基磺酸钠。

5.2RNA提取试剂Trizol。

5.3三氯甲烷。

5.4焦炭酸二乙酯（DEPC）处理水，实验用水应符合GB/T6682的要求。

5.5磷酸盐缓冲液（PBS），见附录A.1。

5.6蛋白酶K（10mg/mL），见附录A.2。

5.7异丙醇。

5.8Tris•饱和酚。

5.9酚-三氯甲烷-异戊醇（25:24:1）。

5.1075％乙醇，见附录A.3。

5.11乙酸钠（3mol/L，pH5.4）。

5.12无水乙醇。

5.13核糖核酸酶（20mg/mL）。

5.14TAE电泳缓冲液，见附录A.4。

5.1510×加样缓冲液，见附录A.5。

5.16对照样品：DHAV-1、DHAV-3、MDPV、GPV、MDRV、N-MDRV和H9-AIV阳性对照样品均为以上病毒

接种的番鸭胚尿囊液；阴性对照样品：未接种的正常番鸭胚尿囊液；以灭菌PBS为空白对照。

5.17引物设计与合成：分别根据DHAV基因组3’端核苷酸序列、GPV和MDPV基因组NS基因、MDRV的

δC蛋白基因片段保守区设计特异性引物；H9亚型AIVHA基因特异引物均参照农业部颁布的《禽流感

防治技术规范》（农医发[2007]12号）进行合成，引物序列及预期片段大小说明见表1：

表1

病毒名称引物预期片段大小说明

F:5’-AGGCCCAGAAGCATTCAAACA-3’

DHAVDHAV-1为258bp，DHAV-3为321bp

R:5’-TGGGTGTTTTACGTGTACTC-3’

F:5’-CAATGGGCTTTTACCAATATGC-3’

GPV和MDPV641bp

R:5’-ATTTTTCCCTCCTCCCACCA-3’

F:5’-GAATCGTGGTCTAGCGAC-3’

MDRV580bp

R:5’-CTCGCATCTGCTGATCATAATTACC-3’