YY/T 1810-2022 组织工程医疗产品 用以评价软骨形成的硫酸糖胺聚糖(sGAG)的定量检测

ICS1104040

CCSC.30.

中华人民共和国医药行业标准

YY/T1810—2022

组织工程医疗产品用以评价软骨形成的

硫酸糖胺聚糖sGAG的定量检测

()

Tissue-engineeredmedicalproducts—Quantificationofsulfated

lcosaminolcanssGAGforevaluationofchondroenesis

gygy()g

ISO130192018MOD

(:,)

2022-07-01发布2023-07-01实施

国家药品监督管理局发布

YY/T1810—2022

目次

前言

…………………………Ⅰ

范围

1………………………1

规范性引用文件

2…………………………1

术语和定义

3………………1

概述和原理

4………………2

试剂仪器和器材

5、…………………………2

测试样品中平行测试样品的准备

6………………………3

实验步骤

7…………………3

检测报告

8…………………5

评价

9………………………6

附录资料性试剂

A()……………………7

附录资料性含量检测报告模板

B()sGAG……………8

附录资料性实验流程图

C()……………10

附录资料性供选择的预处理方法

D()…………………11

附录资料性供选择的提取方法

E()sGAG……………12

参考文献

……………………14

YY/T1810—2022

前言

本文件按照标准化工作导则第部分标准化文件的结构和起草规则的规定

GB/T1.1—2020《1:》

起草

。

本文件使用重新起草法修改采用组织工程医疗产品用以评价软骨形成的硫酸

ISO13019:2018《

糖胺聚糖的定量检测

(sGAG)》。

本文件与的技术性差异及其原因如下

ISO13019:2018:

关于规范性引用文件本文件做了具有技术性差异的调整以适用我国的技术条件调整的情

———,,,

况集中反映在第章规范性引用文件中具体调整如下

2“”,:

增加引用了见第章

●GB/T36988(2,6.1);

补充引用了见第章

●ISO13022:2012(2)。

本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别专利的责任

。。

本文件由国家药品监督管理局提出

。

本文件由全国外科植入物和矫形器械标准化技术委员会组织工程医疗器械产品分技术委员会

归口

(SAC/TC110/SC3)。

本文件起草单位中国食品药品检定研究院四川大学四川医疗器械生物材料和制品检验中心

:、()。

本文件主要起草人魏利娜杨晓琴张乐李娜梁洁徐丽明

:、、、、、。

Ⅰ

YY/T1810—2022

组织工程医疗产品用以评价软骨形成的

硫酸糖胺聚糖sGAG的定量检测

()

1范围

本文件给出了硫酸糖胺聚糖的定量检测方法

(sulfatedglycosaminoglycans,sGAG)。

本文件适用于关节软骨半月板弹性软骨组织工程软骨的细胞外基质中含量检测

、、、sGAG。

注本文件中给出的方法也适用于对含有的外科修复材料进行含量检测

:sGAG。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中注日期的引用文

。,

件仅该日期对应的版本适用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于

,;,()

本文件

。

组织工程用人源组织操作规范指南

GB/T36988

含人源活细胞医疗产品风险管理应用和工艺要求

ISO13022:2012(Medicalproducts

containingviablehumancells—Applicationofriskmanagementsandrequirementsforprocessing

practices)

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件

。

31

.

组织工程软骨tissueengineeredcartilage

通过将软骨细胞或干细胞等活细胞与支架或其他类型的生物材料结合或不与材料结合而获得的

,,

软骨

。

32

.

硫酸糖胺聚糖sulfatedglycosaminoglycanssGAG

;

以重复二糖为单元的硫酸化位置可变的无支链长链聚合物

。

示例硫酸软骨素硫酸角质素硫酸皮质素

:、、。

33

.

测试样品testsample

一份组织工程软骨或再生软骨

()。

3.1

34

.

平行测试样品paralleltestsample

从测试样品中分出的三份样品之一

(3.3)。

注该方法给出每个平行测试样品检测值

:sGAG。

35

.

半胱氨酸cysteine

一种用于消化溶液制备的非必需含硫氨基酸

。

1

YY/T1810—2022

36

.

木瓜蛋白酶papain

用于消化不同组织细胞外基质的半胱氨酸蛋白酶

。

来源酶学委员会编号

[:(EC)]

37

.

19-二甲基亚甲基蓝19-dimethylmetheleneblue

,,

一种能与多种特异性结合的且吸光度与所结合的含量呈线性关系的染料

sGAG(3.2)sGAG。

38

.

6-硫酸软骨素chondroitin6-sulfate

一种硫酸化的糖胺聚糖是软骨和结缔组织的重要组成成分

(sGAG),。

4概述和原理

由于是天然软骨的细胞外基质主要成分之一因此在评价组织工程构建物的软骨形成时

sGAG,

含量是首选的检测指标

sGAG。

使用酶消化测试样品使释放到消化液中并与能和结合的染料孵育后测定吸光度

,sGAG,sGAG,

根据标准曲线换算成消化液中浓度然后用测试样品的质量湿重或干重或含量进行归

sGAG,()DNA

一化计算可测定单位质量或含量样品中的含量

,DNAsGAG。

本文件中的方法可用于检测组织工程软骨的含量可提供标准曲线

sGAG,3μg/mL~100μg/mL

的动态测量范围

。

本文件选用了广泛应用于定量检测的二甲基亚甲基蓝染料用于定

sGAG1,9-(DMMB),sGAG

量检测

。

定量检测包括以下步骤

sGAG:

预处理

a);

的提取释放到消化液中

b)sGAG();

实验测定含量

c)DMMBsGAG;

含量的归一化计算

d)sGAG。

为了实现准确的定量应注意如质量和体积的称量取样移液管的操作和标准曲线的绘制等关键

,、

步骤

。

在检测过程中除另有说明外仅使用公认的分析级蒸馏水或同等纯度水见附录

,,(A)。

附录对测量的报告格式进行了举例说明

BsGAG。

5试剂仪器和器材

、

51试剂

.

本实验使用的试剂见附录

A。

52仪器和器材

.

本实验使用的仪器和器材包括

:

超净工作台

a);

灭菌器例如高压灭菌锅

b),;

倒置显微镜

c);

细胞培养箱浓度二氧化碳温度具有一定湿度的培养环境

d),5%,37℃,;

2

YY/T1810—2022

细胞计数装置例如血细胞计数器

e),;

注如适用可参考

:,ISO20391-1:2018。

离心机

f);

天平

g);

加热装置能够维持最好是恒温箱试管中液体能均匀受热

h),60℃,,;

分光光度计或者酶标仪

i);

无菌刀片

j);

无菌离心管

k);

无菌组织培养皿

l)。

6测试样品中平行测试样品的准备

61概述

.

组织工程软骨及其平行测试样品应假定具有潜在传染性如果涉及人源细胞按照和

,,GB/T36988

采取相应的预防措施其中中含人源活细胞医疗产品可被解读为

ISO13022:2012。ISO13022:2012“”

本文件中的组织工程软骨

“”。

62平行测试样品的制备

.

组织工程软骨和平行测试样品应谨慎操作用于切割组织工程软骨的工具应无菌避免污染

,,。

配制含有盐酸半胱氨酸和乙二胺四乙酸二钠

a)5mmol/L(cysteine-HCl)5mmol/L(EDTA-2Na)

的磷酸盐缓冲液氯化钠氯化钾磷酸氢二钠

(PBS):(NaCl)8.00g/L、(KCl)0.20g/L、(Na2HPO4)

磷酸二氢钾用盐酸调整值为用滤膜

1.44g/L、(KH2PO4)0.24g/L,pH7.4,(HCl)pH6.0,0.2μm

过滤除菌并于储存

,4℃;

在超净工作台里从组织工程软骨切一个完整的厚片作为测试样品

b),;

将测试样品分为个形态相同的部分测量其湿重将平行测试样品转移到上述的

c)3,,6.2a)PBS

溶液中

。

注1平行测试样品最小含量检测限是比色皿法或微孔板法

:sGAG0.3μg()0.06μg()。

注2称量样品时确保没有液体

:。

7实验步骤

71概述

.

组织工程软骨中的通过以下四个步骤进行定量检测预处理的提取含量的

sGAG:、sGAG、sGAG

测定以及含量的归一化计算整个实验的流程图见附录

sGAG。C。

平行测试样品预处理

72

.