LY/T 2305-2014 油茶品种微卫星标记鉴别技术规程

ICS65.020.20

B61

中华人民共和国林业行业标准

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LYT23052014

油茶品种微卫星标记鉴别技术规程

TechnicalreulationsofCamelliavarietiesidentificationbSSRmarkers

gy

ㅤㅤㅤㅤ

2014-08-21发布2014-12-01实施

国家林业局发布

/—

LYT23052014

油茶品种微卫星标记鉴别技术规程

1范围

()(、),

本标准规定了以油茶Camellias.幼嫩组织叶片芽等为材料利用微卫星标记法对油茶品

pp

、、、、。

种进行分子鉴定的术语原理主要仪器和设备试剂与溶液操作程序和鉴定

本标准适用于附录中所列油茶品种的鉴别。

A

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.1

微卫星microsatellite

简单重复序列;

simleseuencereeatsSSR

pqp

也称基因组中由个个核苷酸组成的串联重复序列。

2~6DNA

2.2

基因型频率enotefreuenc

gypqy

ㅤㅤㅤㅤ

群体中某一位点特定基因型个体数占全部个体数的比率。

3原理

,,

微卫星广泛分布于植物基因组的不同位置微卫星位点具有高度的遗传多态性微卫星标记具有高

,。

度的物种特异性和良好的扩增重现性是用于植物品种遗传鉴别的首选标记本标准采用高通量测序

,,,

获得了大量微卫星标记通过实验检测筛选了对高度多态性的微卫星标记用于油茶品种的遗传鉴

10

。,,。

别在检验过程中我们可采用真实品种的DNA模板做为标准品从待检苗木中抽样做为待检样品

,,

利用微卫星引物进行扩增时若待检样品与标准品在任一引物扩增位点上基因型不同则可判定待检样

。,

品与标准品不是同一品种当不同引物扩增位点上基因型都相同时可根据标准品种在不同位点上的

,。

基因型频率乘积计算出待检样品与标准品是同一品种的概率

4主要仪器和设备

4.1PCR扩增仪。

离心机/。

4.212000rmin

微量可调移液器(、、、)。

4.32L10L100L1000L

μμμμ

(,)。

4.4EPS-300数显式稳压稳流电泳仪电压10V~300V电流10mA~400mA

(:,:)。

4.5全自动数码凝胶图像分析系统透射紫外波长302nm透射紫外面积20cm×20cm

(:,波长精度,检测范围/

4.6微量核酸蛋白检测仪波长范围190nm~840nm1nm2nL~

gμ

15/)。

000nL

gμ

1

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5试剂与溶液

,。。

5.1除非另有说明在分析中所使用的所有试剂均为分析纯试验中所使用的水均为无菌超纯水

():(),(

5.21molTrisbaseH8.0称取121.1三羟基甲烷Tris溶解于800mL超纯水用30%体积分

pg

),,,。

数的盐酸将pH值调到8.0定容到1L200mL分装后高压灭菌室温保存

():(),

5.30.5molEDTAH8.0称取186.1乙二胺四乙酸EDTA溶解到800mL超纯水用20%的

pg

(),,,。

约调值至定容到分装后高压灭菌室温保存

NaOH20mLpH8.01L

:,,。

5.45molNaCl称取58.44g氯化钠用150mL超纯水溶解定容到200mL后高温灭菌室温保存

:溴代十六烷基三甲胺()用双蒸水溶解后定容到后高压灭菌。

5.510%CTAB10gCTAB100mL

():,,

5.65mol乙酸钾KAc称取122.7g乙酸钾溶解到200mL超纯水定容到250mL后高压灭菌室

温保存。

三氯甲烷异戊醇:,。

5.7∶240mL三氯甲烷和10mL异戊醇混匀后在棕色瓶中室温保存

:(),,。

5.82%SDS称取2g十二烷基磺酸钠SDS粉末双蒸水溶解后定容到100mL高温灭菌

5.9CTAB提取液:提取液的主要成分为/()、/(

CTAB10mmolLTrisH8.020mmolLEDTAH

pp

)、/、、、/。

巯基乙醇在的超纯水中加入

8.01.4molLNaCl1%CATB5%PVP300mmolLβ-50mL

的,的、的、的、

1mL1molTris4mL0.5molEDTA28mL5molNaCl10mL10%CTAB5PVP-40

g

粉末、(),。

2mL巯基乙醇用前加入定容到

β-100mL

:,,,,。

5.10TE缓冲液0.2mL0.5molEDTA10mL1molTris-HCl用双蒸水定容到1L高压灭菌

():,(

5.11TBE缓冲液10×称取108Tris碱和55硼酸加入40mL0.5molEDTA溶液H=

ggp

),,。

8.0用800mL双蒸水溶解后定容到1L高温灭菌

ㅤㅤㅤㅤ

6操作程序

6.1取样

。()

选用油茶幼嫩叶片或其他幼嫩器官和组织提取DNA本标准选用已通过我国国家审认定和地

,。

方审定的油茶优良品种见附录A

、

6.2DNA的提取纯化及定量

6.2.1CTAB法提取DNA:

),。

a取油茶新鲜幼嫩叶片2~3片或顶芽0.5~1.0在液氮中迅速研磨成粉末

gg

)将粉末转入含有提取液(/,;/,;

b400LCTAB10mmolLTrisH8.020mmolLEDTAH8.0

μpp

/;;;/)。

巯基乙醇的的离心管中

1.4molLNaCl1%CATB5%PVP300mmolL-2mL

β

)/,。

c加入10mmLRnase10L充分混匀

gμ

),。

在下保温其间温和混匀次

d65℃15min2~3

),。

e取出后加入400L2%SDS充分混匀后在65℃保温15min

μ

),。

f加入5mol醋酸钾130L混匀后放冰上保存10min

μ

),。

再加入氯仿异戊醇的抽提液轻微混匀

g∶=24∶1800L

μ

)用/离心。

h12000rmin10min

)转移上清液到新的离心管中。

i2.0mL

),/。

j加入等体积预冷的异丙醇在-20℃冻存1h后在12000rmin下离心5min

),,/,。

k去除上清液加入500L70%的乙醇浸泡5min12000rmin离心重复一次

μ

2

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),/。

l再加入500L无水乙醇清洗一次在12000rmin下离心5min

μ

),。

m去上清液自然干燥待乙醇完全挥发后用200LTE溶解

μ

),。

n溶解后涡旋混匀在-80℃长期保存

6.2.2DNA定量及质量检测:

),/。

取用微量核酸蛋白检测仪检测可以直接读出浓度和的比值

a2LDNADNAA260280

μ

),,,

另取加溴酚蓝在的琼脂糖凝胶上电泳稳压电泳缓冲液为

b3LDNA3L1%100V1×

μμ

,。

TBE电泳结束后用凝胶成像系统记录拍照

)植物总样品只呈现一条相对分子质量较大而迁移速率很小的整齐清晰条带。

cDNA

),/,。

对照微量核酸蛋白检测仪的定量结果将样品稀释成浓度为在下保存

d20nL-80℃

gμ

6.3SSR分析步骤

,

6.3.1SSR引物是根据油茶基因组测序所获得的数据库自行设计并经过筛选的多态性引物具体引物

及序列见附录B。

,。

6.3.2PCR反应体系为15L具体见表1

μ

表1PCR反应体系

一个反应所需体积

试剂母液浓度

μL

1×PCRbuffer10×PCRbuffer1.5

/

BSA10mmL0.15

g

ㅤㅤㅤㅤ

酶()/

TaqTakara5UL0.1

μ

()

PrimerR+F5mmol2

/

DNA20nL2

gμ

MCl10mmol1.2

g2

dNTP5mmol0.3

dUTP250nmol1

HO6.75

2

6.3.3PCR反应程序:

,/,,

反应液加入到板后在下离心将板用乳胶盖盖好后放入仪中

PCR3000rmin5sPCRPCR

PCR的程序为:

)。

a94℃4min

),(),,。

b94℃30s60℃30s每个循环温度降低0.5℃72℃1min10个循环

),,,个循环。

c94℃30s55℃30s72℃1min35

)延伸,保存。

d72℃10min4℃

6.3.4PCR产物变性:

)产物用双蒸水稀释倍。

aPCR10~15

)(,),。

取加入到的超纯甲酰胺内标混匀

b1L9LLoadinbuffer91%9%Genescan500Rox

μμg

):,。

c在仪上运行变性程序变性放冰上迅速冷却

PCR95℃5min

6.3.5PCR扩增产物检测:

),

aPCR产物检测采用ABIPRISM3130xl分析系统采用美国ABI公司生产的50cm16道毛

3

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细管。

)():,

b毛细管的空间校正新安装的毛细管只要进行一次校正即可选择空间校正程序根据毛细

,,。,

管是否已经灌胶选择相应的程序然后点击开始空间校正后每个毛细管会有一个峰图如

,“”,。

果每个毛细管峰值大小基本一致且每个峰上都有一个+则代表校正通过

)()。,

c仪器的光谱校正新安装的毛细管只要进行一次校正即可取5LMulti-CaillarDS-30

μpy

,,,

加入高纯度甲酰胺混匀后分装到孔板和孔变性放

195L96A1-H1A2-H295℃5min

μ

。,,。

冰上迅速冷却利用光谱校正程序进行光谱校正选择校正所用的样品型号然后点击开始

。,

校正结束后通过校正文件图来判断校正是否通过根据DS-30中的标样如果峰图颜色的顺

、、、,、。

序是蓝绿黄红并且峰图清晰峰型一致则代表光谱校正通过

),。

d采用片段分析程序选择片段分析模式以及光谱校正所用试剂盒的类型创建一个自动分析

,,、、。

模板填写分析样品的名称选择样品的类型内标类别分析方法等将产物变性好的PCR

,。,

板盖上仪器自带的PCR板盖放入仪器中在软件中将PCR板链接到仪器点击开始进行基

因型分型。

7待检样品检测的一般程序

待检样品检测的一般程序为:

),;

a随机选取一对引物对待检样品进行PCR扩增

),

将扩增得到的条带和附录中的标准谱带相比较如果一个引物扩增出待检样品和其中的几

bC

,,;

个品种相同则再增加一对引物扩增待检品种直到能检测出待检样品

),。

c根据基因型频率判定所鉴定品种真实性的准确率参见附录D

ㅤㅤㅤㅤ

4

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附录

A

()

规范性附录

本标准选用的油茶品种表

表A.1本标准选用的油茶品种表

序号品种名称拉丁名序号品种名称拉丁名

赣石‘’黄山号‘’

183-1C.oleieraGanshi83-1271C.oleierahuangshan1

ff

赣石‘’黄山号‘’

283-4C.oleieraGanshi83-4282C.oleierahuanshan2

ffg

赣石‘’黄山号‘’

384-3C.oleieraGanshi84-3293C.oleierahuanshan3

ffg

赣无‘’黄山号‘’

42C.oleieraGanwu2305C.oleierahuanshan5

ffg

白市号‘’瓮洞号‘’

54C.oleieraBaishi-43124C.oleieraWendon-24

ffgg

岑软‘’瓮洞号‘’

611C.oleieraCenruan-11328C.oleieraWendon-8

ffgg

岑软号‘’湘林号‘’

72C.oleieraCenruan-2331C.oleieraxianlin1

ffg

岑软‘’湘林‘’

822C.oleieraCenruan-2234210C.oleieraxianlin210

ffg

岑软‘’湘林‘’

924C.oleieraCenruan-24357C.oleieraxianlin7

ffg

岑软号‘’湘林‘’

103C.oleieraCenruan-33678C.oleieraxianlin78

ffg

大别山号‘’阳新米茶‘’

111C.oleieradabieshan137C.oleieraanxinmi

ffyg

ㅤㅤㅤㅤ

大别山号‘’阳新桐茶‘’

122C.oleieradabieshan238C.oleieraanxinton

ffygg

大别山号‘’长林‘’

133C.oleieradabieshan339166C.oleieraChanlin166

ffg

大别山号‘’长林号‘’

144C.oleieradabieshan44018C.oleieraChanlin18

ffg

鄂林油茶‘’长林号‘’

15102C.oleieraelin1024121C.oleieraChanlin21

ffg

鄂林油茶‘’长林号‘’

16151C.oleieraelin1514222C.oleieraChanlin22

ffg

鄂油号‘’长林号‘’

17276C.oleieraeou2764323C.oleieraChanlin23

fyfg

鄂油号‘’长林号‘’

18361C.oleieraeou3614427C.oleieraChanlin27

fyfg

鄂油号‘’长林号‘’

19424C.oleieraeou424453C.oleieraChanlin3

fyfg

鄂油号‘’长林号‘’

20465C.oleieraeou465464C.oleieraChanlin4

fyfg

鄂油号‘’长林号‘’

2154C.oleieraeou544740C.oleieraChanlin40

fyfg

鄂油号‘’长林号‘’

2263C.oleieraeou634853C.oleieraChanlin53

fyfg

鄂油号‘’长林号‘’

2381C.oleieraeou814955C.oleieraChanlin55

fyfg

赣‘’油茶闽‘’

248C.oleieraGan85060C.oleieraMin60

ff

25赣无11‘’51油茶闽48‘’

C.oleieraGanwu11C.oleieraMin48

ff

赣兴