T/CIS 67002-2021 3种剧毒鹅膏菌的物种鉴别PCR扩增-Sanger测序法

ICS67050

CCSX.04

中国仪器仪表学会标准

T/CIS67002—2021

3种剧毒鹅膏菌的物种鉴别

PCR扩增-Sanger测序法

Speciesidentificationofthreelethalamanitas—PCRamplification-

Sangersequencing

2021-11-01发布2022-01-01实施

中国仪器仪表学会发布

本标准由中国仪器仪表学会制定其著作权为中国仪器仪表学会所有除

,。

了用于法律许可范围或事先得到中国仪器仪表学会文字上的许可外不许以任何形式再复

,

制本标准如果关于本标准有任何著作权/版权或相关咨询请联系中国仪器仪表学会或

。,

本标准出版社

!

中国仪器仪表学会简称是中国仪器仪表与

(ChinaInstrumentandControlSociety)CIS,

测量控制科学技术工作者自愿组成并依法登记成立的学术性公益性非营利性社团法人是

、、,

联系仪器仪表与测量控制科技工作者的桥梁和纽带是发展中国仪器仪表与测量控制科学技

,

术事业的重要社会力量

。

地址北京市海淀区知春路号锦秋国际大厦座层邮编

:6A23:100088

电话传真

:86-10-82800385:86-10-82800485

网址电子邮箱

::scis@

T/CIS67002—2021

目次

前言

…………………………Ⅲ

引言

…………………………Ⅳ

范围

1………………………1

规范性引用文件

2…………………………1

术语和定义

3………………1

缩略语

4……………………2

原理

5………………………2

试剂及配制

6………………2

仪器和设备

7………………3

鉴别分析步骤

8……………3

采样

8.1…………………3

试样制备

8.2……………4

提取

8.3DNA……………4

扩增

8.4PCR……………4

产物电泳检测

8.5PCR…………………5

产物纯化及胶回收

8.6PCR……………5

克隆纯化

8.7……………5

测序

8.8…………………5

序列分析

8.9……………5

结果判断与表述

9…………………………5

结果判断

9.1……………5

结果表述

9.2……………6

检测过程中防止交叉污染的措施

10………………………6

危害性废弃物处理

11………………………6

附录资料性产物纯化及胶回收示例

A()PCR…………7

附录资料性克隆纯化示例

B()…………9

附录资料性参考序列

C()………………10

Ⅰ

T/CIS67002—2021

前言

本文件按照标准化工作导则第部分标准化文件的结构和起草规则的规定

GB/T1.1—2020《1:》

起草

。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别专利的责任

。。

本文件由中国仪器仪表学会提出并归口

。

本文件起草单位国家食品安全风险评估中心湖南师范大学江西省疾病预防控制中心浙江省疾

:、、、

病预防控制中心辽宁省疾病预防控制中心

、。

本文件主要起草人李楠陈作红江涛王佳慧何正蜜张眉眉刘洋陈鸿鹄耿英芝

:、、、、、、、、。

Ⅲ

T/CIS67002—2021

引言

采用扩增测序法鉴别致命鹅膏等种剧毒鹅膏菌以鹅膏菌基因组为模板针

PCR-Sanger3,DNA,

对区域进行扩增克隆和测序通过与参考序列比对进而对物种进行鉴

ITS1-5.8SrDNA-ITS2PCR、,

别其优点在于突破了形态学鉴定的局限性不受样品个体形态特征发育阶段的影响和限制从

。,、,DNA

水平为引发食物中毒或相关研究的鹅膏菌的物种鉴别提供依据

。

本文件的制定目的是为致命鹅膏等种剧毒鹅膏菌的物种鉴别提供统一的操作程序使其鉴别实

3,

现标准化从而显著提升蘑菇中毒事件的检测鉴别和防控能力

,、。

Ⅳ

T/CIS67002—2021

3种剧毒鹅膏菌的物种鉴别

PCR扩增-Sanger测序法

1范围

本文件给出了种剧毒鹅膏菌物种鉴别的扩增测序法

3PCR-Sanger。

本文件适用于致命鹅膏Amanitaexitialis灰花纹鹅膏Amanitauliinea和裂皮鹅膏

()、(fg)

Amanitarimosa的物种鉴别

()。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中注日期的引用文

。,

件仅该日期对应的版本适用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于

,;,()

本文件

。

分析试验用水规格和试验方法

GB/T6682—2008

转基因产品检测实验室技术要求

GB/T19495.2—2004

实验室质量控制规范食品分子生物学检测

GB/T27403—2008

动物制品中动物源性检测基因条码技术测序法

GB/T35918—2018Sanger

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件

。

31

.

鹅膏菌amanita

隶属于真菌界担子菌门担子菌纲伞菌目鹅膏菌科鹅膏属的真菌

、、、、、。

32

.

Sanger测序法Sangersequencing

双脱氧链终止法

以单链或双链为模板在聚合酶的催化下延伸结合在模板上的引物直到掺入一种链

DNA,DNA,

终止核苷酸为止每个反应含有四种并混入用同位素或荧光标记的使延长的寡聚核

。dNTP,ddNTP,

苷酸选择性终止通过高分辨率变性毛细管电泳分离片段获得碱基顺序的方法

,。

来源

[:GB/T35918—2018,3.1.2]

33

.

可疑蘑菇样品suspiciousmushroomsamples

在蘑菇中毒事件中中毒者食用剩余的蘑菇样品或流行病学调查中采集到的经中毒者确认其所进

,,

食的蘑菇样品

。

34

.

呕吐物样品vomitsamples

中毒者呕吐的胃内容物

。

1