GB/T 35520-2017 化学品 胚胎毒性 胚胎干细胞试验

;

ICS13.30011.100

A80

中华人民共和国国家标准

/—

GBT355202017

化学品胚胎毒性胚胎干细胞试验

——

ChemicalsEmbrotoxicitEmbronicstemcelltest

yyy

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2017-12-29发布2018-07-01实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

中国国家标准化管理委员会

/—

GBT355202017

前言

本标准按照/—给出的规则起草。

GBT1.12009

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Ⅰ

/—

GBT355202017

引言

(,)。

小鼠胚胎干细胞EmbronicstemcellsES在不同的培养条件下会分化为不同的胚胎组织因

y

[]

1

,。

此一些研究小组使用小鼠细胞进行体外胚胎毒性试验等比较了细胞和小鼠纤

ESLaschinskiES

[]

2-3

,。

维母细胞的细胞毒性以评估致畸物的潜在胚胎毒性等比较了细胞的细胞毒性和分化

HeuerES

[]

4

。,,

抑制和测定了培养后致畸物对细胞的细胞毒性和集落形成能力的影响

NewallBeedles7dES

,。,

这适用于常规测试因为集落形成这一终点可自动化完成在所有这些试验中只有一些胚胎毒性物能

。。

够被正确分类这可能是由于在试验中选择个终点不足以评估胚胎毒性

ES2

[]

,5(、

为克服上述细胞试验的限制等确定了个不同的试验终点半数分化抑制浓度

ESSielmann3

p

)。。

细胞半数生长抑制浓度和细胞半数生长抑制浓度根据这些终点可导出个变量所得的

D33T33

个变量作为受试物分为。

33个体内胚胎毒性等级的依据这种方法有利于给出胚胎组织与成体组织之

。,

间对化合物细胞毒性损伤的敏感性差异事实上利用判别分析已将种受试化学品正确归入已知的

16

[]

5-6

3种体内胚胎毒性等级。这是第一个不处死妊娠动物而获得体外培养所需胚胎组织的体外胚胎毒

性测试。

在本标准中为验证研究制定的标准操作程序克服了实验室中状态维持的问题,细胞通常倾

ESES

向于自发分化。

,,(

此外根据制定的性能标准欧盟替代方法验证中心EuroeanCentrefortheValidationofAlter-

p

,)()。

nativeMethodsECVAM验证研究表明体外数据和体内数据之间具有较好的相关性准确性78%

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,()、()。,

据报道强胚胎毒性化学品的预测性100%极好精确度81%良好据报道无胚胎毒性物质和胚胎

[]

7

()()()。

毒性弱的物质的预测性分别为和和无胚胎毒性物质的精确度较高

72%70%70%≥65%

,,,

然而一个特例出现于强胚胎毒性化学品氯化甲基汞的错误分类在个试验中的个试验里被

84

,。

预测为无胚胎毒性的化学品而不是强胚胎毒性的化学品这种误分类出现的原因可能是用于建立预

[]

6

测模型的训练集未包括具有类似细胞毒性模式的化学品。

Ⅱ

/—

GBT355202017

化学品胚胎毒性胚胎干细胞试验

1范围

、、、

本标准规定了化学品胚胎毒性胚胎干细胞试验的术语和定义试验原理试验方法质量控制和结

果评价。

本标准适用于应用胚胎干细胞试验测试化学品的胚胎毒性。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.1

半数分化抑制浓度medianinhibitionofdifferentiation

ID50

化学品抑制50%ES细胞分化为心肌细胞的浓度。

2.2

D3细胞半数生长抑制浓度medianinhibitionofrowthofD3

g

IC

50D3

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化学品抑制细胞系生长和活性的浓度。

50%ESD3

2.3

3T3细胞半数生长抑制浓度medianinhibitionofrowthof3T3

g

IC

503T3

化学品抑制50%3T3细胞生长和活性的浓度。

3试验原理

,、

胚胎毒性测试或用妊娠动物进行体内试验或用培养的胚胎以及取自妊娠动物的胚胎组织细胞进

[]

8

。,。

行体外试验不管体内还是体外测试都得处死妊娠动物利用胚胎干细胞体外培养无限增殖与分

[]

9

,,。

化的潜能提出了一种利用小鼠永生化细胞系的体外胚胎毒性测试即胚胎干细胞试验

,

本试验是基于胚胎毒性作用中最重要的指标即受试物对胚胎组织和成体组织的毒性损伤存在敏

,。,()

感性差异这种差异与胚胎分化抑制密切相关使用两个永生化小鼠细胞系ES细胞D3和纤维母细

()。(),

胞3T3细胞分别表示胚胎组织和成体组织只有在添加小鼠白血病抑制因子mLIF的培养条件下

。,(),

ES细胞保持在未分化阶段才可进行该试验去除未分化状态ES细胞会形成拟胚体EB并在适当

条件下分化为主要胚胎组织。

[]

1

细胞毒性数据表明,细胞比成体细胞对毒性药剂更敏感。细胞分化抑制和细胞与

ESESES3T3

细胞生长抑制是中用于预测化学品潜在胚胎毒性的个选用的终点。

EST3

1

/—

GBT355202017

4试验方法

4.1材料

4.1.1细胞系

/,,,,(:)

BALBc3T3细胞细胞克隆A31号建议使用德国EscheweeICN-Flow编号03-465-83或美

g

(;:)。,(

国典型培养物保藏中心编号小鼠细胞建议使用教授德国

ATCCCCL-163ESD3RolfKemler

·)(;:)。

弗莱堡马克斯普朗克研究所或美国典型培养物保藏中心ATCC编号CRL-1934若使用其他来

,。

源细胞需验证其有效性

4.1.2主要设备

(,)、、()、、

细胞培养箱37℃±1℃5%±1%CO2层流洁净工作台水浴槽37℃±1℃相差显微镜

、。

酶标仪细胞计数器等

、、

4.1.3化学品培养基血清

培养基、、()、/、/、

DMEM谷氨酰胺胎牛血清胰蛋白酶溶液青霉素链霉素二甲亚砜

L-FCSEDTA

()、()、()、()、()、

非必需氨基酸巯基乙醇小鼠白血病抑制因子噻唑蓝

DMSONAAβ-β-MEmLIFMTT

、()、()、()、、

异丙醇十二烷基磺酸钠不含钙镁的磷酸盐缓冲液氟尿嘧啶青霉素台盼

SDSPBS5-5-FUG

、。

蓝乙醇等

4.2试剂的准备国家标准ㅤ可打印ㅤ可复制ㅤ无水印ㅤ高清原版ㅤ去除空白页

4.2.1小鼠白血病抑制因子

产品原液()进行细胞常规传代时直接加入培养板或培养瓶。溶液浓度为6/,

mLIFESLIF10UmL

。,()。7/

-20℃下分装储存解冻后将分装LIF溶液储存在4℃1年稳定如果使用浓度为10UmL的

,(),。

LIF则在PBS含1%BSA或细胞培养基中制备1∶10稀释液并按照厂家说明书如上进行储存

4.2.2胎牛血清

解冻后在下热灭活。

FCS56℃30min

4.2.3巯基乙醇

β-

/,()。

在中制备工作液最长可使用周储存

PBS10mmolL-ME14℃

β

4.2.4完全培养基

。()。

制备不含的完全培养基完全培养基最长使用周储存

LIF14℃

完全培养基配方见表1。

表1完全培养基配方

用途3T3细胞ES细胞

,/谷氨酰胺,/青霉

20%FCS2mmolLL-50UmL

,/谷氨酰胺,/

10%FCS4mmolLL-50UmL

常规培养素,/链霉素,,/

50mL1%NAA0.1mmolL-

μgβ

青霉素,/链霉素

50μgmL

,/()

ME1000UmLmLIF直接加入培养板中

2

/—

GBT355202017

()

表续

1

用途3T3细胞ES细胞

,/谷氨酰胺,/,/谷氨酰胺,/青霉

10%FCS4mmolLL-50UmL20%FCS2mmolLL-50UmL

试验

青霉素,/链霉素素,/链霉素,,/

50mL50mL1%NAA0.1mmolL-ME

μgμgβ

,/谷氨酰胺,/青霉

40%FCS2mmolLL-50UmL

,/谷氨酰胺,/

20%FCS4mmolLL-50UmL

冻存素,/链霉素,,/

50μgmL1%NAA0.1mmolLβ-

青霉素,/链霉素,

50mL10%DMSO

μg

,

ME10%DMSO

4.2.5MTT溶液

/,(),。

以PBS制备5mMTTmL储备溶液过滤0.2m分装储存于-20℃

gμ

4.2.6MTT裂解液

(),。(,

3.49mL20%SDS储备溶液终浓度为0.7%加96.51mL异丙醇临用现配若出现沉淀物加

热至37℃)。

4.3试验步骤

4.3.1ES细胞分化试验(测定)

ID

50

,。溶剂终

受试化学品所用溶剂及最大试验浓度选择参见附录A浓度级数的设计参见附录B

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,,。

浓度应保持一致无细胞毒性不应对细胞分化产生任何其他影响所有化学品的最高受试溶度为

/。(),、

1000mL不应使用完全培养基含添加物配制储备液避免血清蛋白受试化学品或其他成分反

μg

复冻融时产生沉淀。

,。(

进行各试验前对化学品称重和溶解包括作为阳性对照的第天和第天使用时更

5-FU35

),()。

换培养基可使用试验开始前制备的储备液若在-20℃分装储存阳性对照和阴性对照化学品盘

/,。

尼西林可从冷冻储备溶液中配制阳性对照为固定浓度

G100mmLPBS5-FU

g

,

由于强酸和强碱可能会影响培养基的缓冲容量培养基稀释后需通过光学检测给出化学品最

。(),/

高测试浓度的值如果培养基变为紫色或金黄色或应使用

HH>8H<6.50.1molLNaOH

ppp

或/中和受试化学品的储备溶液。

0.1molLHCl

。,(

细胞分化试验按照附录程序进行第天在测试培养基和含细胞的溶液

C0ES3.75×

4/)。,

10细胞mL中制备一定浓度序列的受试化学品在培养基中制备受试化学品后最后添加胰蛋白酶

,。,

消化细胞以避免细胞在培养箱外放置时间过长在培养皿中制备细胞悬液防止

ES60mmESES

。,,(

细胞粘附在完成下列步骤时应不时轻微拍打细胞使其悬浮室温条件下放置时间尽可能短将一小

,。)。

份细胞悬液进行台盼蓝染色试验检测细胞活性活性≥90%可用于试验注意不应超出允许的溶剂

,。

最高浓度保持受试化学品各浓度溶液中的溶剂浓度一致利用移液器将20L含有适当受试化学品

μ

()。。

的