GB/T 43650-2024 野生动物及其制品DNA物种鉴定技术规程

ICS6502001

CCSB.60.

中华人民共和国国家标准

GB/T43650—2024

野生动物及其制品DNA物种鉴定

技术规程

TechnicalproceduresforDNAspeciesidentificationofwildanimalsand

theirproducts

2024-03-15发布2024-07-01实施

国家市场监督管理总局发布

国家标准化管理委员会

GB/T43650—2024

目次

前言

…………………………Ⅲ

范围

1………………………1

规范性引用文件

2…………………………1

术语定义和缩略语

3、………………………1

术语和定义

3.1…………………………1

缩略语

3.2………………2

样品采集与储存

4…………………………2

样品采集

4.1……………2

抽样

4.2…………………2

取样与储存

4.3…………………………2

运输

4.4…………………3

鉴定程序的构成

5DNA……………………4

鉴定程序

6DNA……………4

样品前处理

6.1…………………………4

提取

6.2DNA……………5

纯化

6.3DNA……………5

质量评估

6.4DNA………………………5

检测方法

6.5……………6

结果表述

7…………………10

追溯方法

8…………………10

污染预防与处理

9…………………………10

实验室区域设置

10………………………10

仪器和试剂要求

11………………………10

实验室清洁

12……………10

安全防护

13………………10

废弃物处理

14……………10

附录资料性电泳检测程序

A()…………11

常规电泳检测法

A.1…………………11

芯片电泳检测法

A.2…………………12

其他电泳检测法

A.3…………………12

附录资料性通用引物序列信息

B()……………………13

Cytb基因通用引物

B.1………………13

COI基因通用引物

B.2………………13

Ⅰ

GB/T43650—2024

SrRNA基因通用引物

B.312…………13

SrRNA基因通用引物

B.416…………13

附录资料性通用引物反应体系与反应程序

C()PCR………………15

反应体系

C.1……………15

反应程序

C.2……………15

附录资料性特异性的引物反应程序与反应体系

D()PCR、…………16

高鼻羚羊Saigatatarica特异引物

C.1()……………16

雪豹Pantherauncia特异引物

C.2()…………………16

豹Pantherapardus特异引物

C.3()…………………17

虎Pantheratigris特异引物

C.4()……………………17

黑熊Ursusthibetanus特异引物

C.5()………………17

附录资料性反应体系与反应程序

E()qPCR…………18

反应体系

E.1……………18

反应程序

E.2……………18

附录资料性反应体系与反应程序

F()dPCR…………19

反应体系

F.1……………19

反应程序

F.2……………19

参考文献

……………………20

Ⅱ

GB/T43650—2024

前言

本文件按照标准化工作导则第部分标准化文件的结构和起草规则的规定

GB/T1.1—2020《1:》

起草

。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别专利的责任

。。

本文件由国家林业和草原局提出

。

本文件由全国野生动物保护管理与经营利用标准化技术委员会归口

(SAC/TC369)。

本文件起草单位东北林业大学东北林业大学司法鉴定所深圳华大生命科学研究院中国海关科

:、、、

学技术研究中心黑龙江省公安厅哈尔滨检验检测认证集团有限公司深圳华大法医科技有限公司广

、、、、

东华大法医物证司法鉴定所黑龙江省野生动物研究所华南动物物种环境损害司法鉴定中心南宁海

、、、

关技术中心南京警察学院合肥海关技术中心广西壮族自治区公安厅东营市公安局

、、、、。

本文件主要起草人白素英马跃王震李波张伟孙磊徐艳春张利峰王剑刘微杨天天兰天明

:、、、、、、、、、、、、

李晓平危金普郭小森李宁金煜张宇孙红瑜马云龙金香香刘闯刘昌景胡诗佳李云飞张新成

、、、、、、、、、、、、、、

唐闳凯

。

Ⅲ

GB/T43650—2024

野生动物及其制品DNA物种鉴定

技术规程

1范围

本文件规定了对野生动物及其制品的来源进行物种鉴定时样品采集与储存鉴定程序

DNA、DNA

的构成鉴定程序结果表述追溯方法污染预防与处理实验室区域设置等主要技术要求

、DNA、、、、。

本文件适用于野生动物及其制品来源物种的检验鉴定

DNA。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中注日期的引用文

。,

件仅该日期对应的版本适用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于

,;,()

本文件

。

实验室生物安全通用要求

GB19489

转基因产品检测实验室技术要求

GB/T19495.2

分立个体类产品随机抽样实施指南

GB/Z31233

水溶液中核酸的浓度和纯度检测紫外分光光度法

GB/T34796

法庭科学实验室检验规范

GA/T383DNA

野生动物及其产品的物种鉴定规范

LY/T2501

兽医诊断样品采集保存与运输技术规范

NY/T541—2016、

3术语定义和缩略语

、

31术语和定义

.

下列术语和定义适用于本文件

。

311

..

DNA条形码DNAbarcode

选定的标准区域的用于物种鉴定的一段相对较短的保守片段

、DNA。

312

..

DNA物种鉴定DNAspeciesidentification

利用检验技术对野生动物及其制品进行分类地位科属种的判定

DNA(、、)。

313

..

序列比对alignment

利用计算机算法和程序确定两个或多个核苷酸序列的相似性以至于同源性

,。

314

..

引物primers

人工合成的两段互补寡核苷酸片段一段与靶区域端模板链互补另一段与靶区域端

,5'DNA;3'

模板链互补

DNA。

1

GB/T43650—2024

315

..

荧光探针fluorescentprobe

端和端分别标记荧光基团和淬灭基团并与目的序列碱基互补的一段片段

5'3',DNADNA。

32缩略语

.

下列缩略语适用于本文件

。

生命条形码数据系统

BOLD:(barcodeoflifedatasystem)

值循环阈值或值

Ct:(cyclethreshold,Cq)

细胞色素

Cytb:b(cytochromeb)

数字

dPCR:PCR(digitalPCR)

聚合酶链式反应

PCR:(polymerasechainreaction)

实时荧光定量

qPCR:PCR(real-timefluorescencequantitativePCR)

限制性片段长度多态性

RFLP:(restrictionfragmentlengthpolymorphism)

4样品采集与储存

41样品采集

.

411样品分成两等份作为检样和储存样

..,。

412规范标记编号记录采集时间地点类型等内容保证样品可追溯

..,、、,。

413样品分别采集分别包装注意工具清洁或消毒防止交叉污染

..、,,。

42抽样

.

421形态特征完整可分类识别的同类多个检材按照中的简单随机抽样或等距抽样规

..、,GB/Z31233

定执行

。

422具有部分形态特征可简单分类的多个检材先分类再按照中的简单随机抽样或

..、,,GB/Z31233

等距抽样规定执行或按照中的分层抽样规定执行

;GB/Z31233。

423不具有可识别的形态特征的大批量检材先按照中的简单随机抽样或等距抽样规

..,GB/Z31233

定执行结果出现多个物种时再按照中的分层抽样规定执行物种的个体数量可按鉴定

,,GB/Z31233。

结果所占比例核算

。

43取样与储存

.

431整体

..

昆虫等小型无脊椎动物可整体取样取适量或整体粉碎收集到离心管或密封袋等储存介质中干

,,,

燥常温冷藏或保存

、-20℃。

432组织和内脏

..

应先去除易污染的表层宜采取新鲜洁净的组织或内脏3以上收集到离心管或密封袋等储

,5mm,

存介质中冷藏暂存宜尽快在以下保存

,,-20℃。

433皮张与蛇蜕等

..

取2以上收集到离心管或密封袋等储存介质中干燥常温冷藏或保存

1cm,、-20℃。

2

GB/T43650—2024

434骨骼与牙齿

..

整体送检或清洗后取不少于骨粉或牙粉组织残留时宜取组织收集到离心管或密封袋等

0.2g(),

储存介质中干燥常温冷藏或保存

,、-20℃。

435皮肤衍生物

..

4351角喙爪鳞龟甲等

...、、、、

整体送检或清洗后取不少于粉末等收集到离心管或密封袋等储存介质中干燥常温冷藏

0.2g,、

或保存

-20℃。

4352毛羽等

...、

收集根以上置于离心管或密封袋等储存介质中干燥常温冷藏或保存

1,、-20℃。

注皮肤衍生物是指由皮肤衍生而成的特殊器官如毛羽喙爪蹄角鳞鳍盾片骨板龟甲等

:,、、、、、、、、、、。

436血液血痕

..()

宜选新鲜全血采集于抗凝管或采血卡血痕宜用采样拭子等采集抗凝管和采样拭子等

EDTA。。

冷藏或保存采血卡晾干常温冷藏或保存

-20℃;,、-20℃。

437尿液

..

用清洁容器或密封袋等收集密封冷藏或保存

1mL~5mL,,-20℃。

438粪便

..

用消毒的镊子或勺等取整颗或在表层和内层各取不低于收集到离心管或密封袋等储存介质

0.2g,

中可加干燥剂或保存液常温冷藏或保存

,,、。

-20℃

439分泌物

..

唾液等用消毒的纱布棉花或拭子等采集晾干密封常温保存或者直接密封冷藏或保存

、,;,-20℃;

收集足量其他分泌物到离心管或密封袋等储存介质中冷藏保存宜尽快于保存

,,-20℃。

注分泌物是指由腺体和组织器官分泌的物质

:。

44运输

.

441样品宜尽快送检干燥样品常温运输鲜软组织等易腐败的样品应冷藏特殊时干冰冷冻

..。,()

运输

。

442每个样品应分别包装在样本袋或容器外标记清楚再将各样品放到统一包装袋或盒中

..,,。

443抗凝管等玻璃容器放入盒内加垫缓冲材料固定防止晃动破裂

..,,,、。

444包装应防水防漏密封性良好

..、、。

445疑似疫病如禽流感等动物样品应先消毒处理后包装按照中的规定

..(),,NY/T541—20167.2

执行

。

3

GB/T43650—2024

5DNA鉴定程序的构成

鉴定程序包括个操作步骤检材无形态鉴别特征时有大类方法可选检材具有部分形态

DNA5,,4;

鉴别特征或理化鉴别指标等时可与之结合进行综合判断程序流程图如图所示