GB/T 35098-2018 微束分析 透射电子显微术 植物病毒形态学的透射电子显微镜鉴定方法

ICS71.040.40

G04

国；

中华人民共和国国家标准

GB/T35098-2018

微束分析透射电子显微术植物病毒

形态学的透射电子显微镜鉴定方法

Microbeamanalysis-Transmissionelectronmicroscopy一

Morphologicalidentificationmethodofplantviruses

bytransmissionelectronmicroscopy

2018-05-14发布2019-04-01实施

国家市场监督管理总局峪非

中国国家标准化管理委员会0(..'I(J

GB/T35098-2018

目次

I

引言………………………n

1范围－

2规范性引用文件－

3术语和定义…··

4基本原理…………………2

5仪器设备、试剂和材料、环境条件·

6试样…

7透射电子!m.微镜鉴定步骤·

8植物病毒形态学鉴定结果的质量要求－

9鉴定报告发布…

10除害处理…

附录A（资料性附录）常用试剂的配方

附录B（资料性附录）植物病毒各科、属的形态学和细胞病理学特征………………10

参考文献……………·15

GB/T35098-2018

附录A

（资料性附录）

常用试剂的配方

A.1磷酸缓冲液配方

A.1.10.2mol/L磷酸缓冲液贮存液

A液0.2mol/L磷酸二氢铀水溶液：

NaH2P01•H2027.60g

或NaH2P01•2H2031.21g

加双蒸倔水至1000mL，混匀。

B液0.2mol/L磷酸氢二铀水溶液：

Na2HP0,1•2H2035.61g

或Na2HP04•12H2071.64g

加双蒸馆水至1000mL，泪匀。

A.1.20.1mol/L磷酸缓冲液

按表A.l所列数量取A液和B液1昆合，配制0.2mol/L磷酸缓冲液贮存液后，如］1倍双蒸饱水即

为0.1mol/L磷酸缓冲液。按不同比例稀释可配制成不同浓度的磷酸缓冲液。

表A.1不罔pH值磷酸缓冲液贮存液配制表

6.46.66.87.07.27.47.67.8

73.562.551.039.028.019.013.08.50

26.537.549目。61.072.081.087.091.5

A.2固定液配方

A.2.1戊二醒固定液

见表A.2。

表A.20.1mol/L磷酸缓冲液配制的戊二醒固定液配制表

0.2mol/L磷酸缓冲浪／mL50505050505050

25%戊二怪水溶液／mL46810121620

1111双蒸饱；J<至／mL100100100100100100100

l.0%J.5%2.0%2.5%3.0%4.0%5.0%

戊二国主最终浓度

（体积分数）（体积分数）（体积分数）（体积分数）（体积分数）（体积分数）（体积分数）

A.2.2四氧化锻固定液

先配置2%(20g/L)llli氧化锚贮存液，再配置1%00g/L）四氧化饿同定液，如下：

7

GB/T35098-2018

a)Z%(20g/L)四氧化锻贮存液

将装有四氧化饿的安部（共0.5g）清洗干净，用玻璃划剖器在上面刻痕，再用双蒸饱水冲洗几次，放

入洁净棕色广口玻璃瓶内，力Ot25mL双蒸倔水，用洁净玻璃棒捣破安部。然后用石蜡将广口玻璃瓶

严密封口，贴上标签，置于干燥器中，4℃下避光保存。

b)0.1mol/L磷酸缓冲液配制的1%(10g/L）凹氧化饿同定液

取等量的0.2mol/L磷酸缓冲液（pH值7.2）与2%(20g/L)四氧化饿贮存液j昆合，现配现用。

A.3包埋剂配方

A.3.1环氧树脂Spurr＇低黠度包埋剂

环氧树脂Spurr’低勃度包埋剂配制表见表A.30

表A.3环氧树脂Spurr’低茹度包埋剂配制表

配方标准偏硬性硬性软性快速聚合缓慢聚合

ERL-4206

10.0g10.0g10.0g10.0g10.0g10.0g

(ERL4221)

DER7366.0g5.0g4.0g7.0g6.0g6.0g

NSA26.0g26.0g26.0g26.0g26.0g26.0g

D扣Li\E0.4mL0.4mL0.4mL0.4mLl.OmL0.2mL

聚合时间70℃／h8888316

混合时间／d3~43~43~43~427

注1：按上述比例将前3和｜！成分混合均匀，再力IIDMAE催化剂搅拌。配好的包理剂在低源和防；如l状态下可保存数

月。此包埋剂百用包埋管包哩，聚合时需1JJI盖，以免包埋块发脆。在70℃温度下聚合shmi可完全聚合。此

包埋剂不易受潮。

注2:ERL-4206(Vinylcyclohexenedioxide），我皮低，聚合块硬度大。目前ERL-4206停产后由ERL-4221替代，它

的勃皮稍大于ERL4206。使用ERL4221时，适当增加DER736的比例可以得到硬度适巾的包埋块。

DER736(Diglycidyletherofpolypropyleneglycol)，属于脂肪族，有低教度性质，可调节包埋块的硬度。

NS八（Nonenylsuccinicanhydride），硬化剂，避免暴露在潮湿的大气巾。

DMAE(2-Dimethylaminoethanol)，催化剂，增加催化剂的比例，可以缩短聚合时问。

A.3.2环氧树脂Epon812包埋剂

环氧剌脂Epon812包埋剂配制表见表A.4。

表A.4环氧树脂Epon812包埋剂配制表

总茧10mL20mL30mL40mL50mL

Epon8125g10g15g20g25g

DDSAl.lg2.2g3.3g4.4g5.5g

扣INA3.9g7.8g11.7g15.6g19.5g

DMP30。.15mL0.30mL0.45mL0.60mL0.75mL

注1：按上述比例配好各成分，充分搅拌30min，驱除气泡。包埋样品分别在37℃、45℃、60℃下聚合12人12b、

24h或直接在60℃泪度下聚合48h。此包埋剂易受潮，可以在干燥器巾保存聚合后的样品包埋块。

8

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注2:Epon812是环氧树脂单休。

DDS/\(Dodecenylsuccinicanhydride）十二炕基就础酸ITT，一种可得到l软性包埋块的长链脂肪族分子。

M＞！八（Methylnadicanhydride）甲基内次甲基二甲酸酶，又称六甲酸西干，有两个链环，能获得较硬的包埋块。

DMP-30口，4,6-Tri(dimethylaminometbyl)pbenol]Z,4,6－三（二甲基氨基甲基）苯IB｝，能力II边同化过程。

A.4超薄切片染色液配方

A.4.1酣酸铀染色液：称取1.0g酣酸铀，用50mL50%（体积分数）的乙醇配制成2%(20g/L)醋酸铀

乙醇溶液，呈1炎黄色，室拥下避光保存。

A.4.2拧模酸铅染色液：称取硝酸铅1.33g、拧藤酸三铀1.76g，放入50mL容量瓶中，如l入预先煮沸

过的双蒸锢水30mL,7昆合后摇荡130min,71昆悬液呈乳向色，加1mol/L::\laOH溶液8mL后棍悬液逐

渐变橙清，pH值为12，再加］双蒸馆水定容至50mL，封闭瓶LI。

A.5负染色液配方

A.5.12%(206日磷鸽酸负染色液

称取1.0g磷鸽酸，用50mL双蒸馆水配制成2%(20g/L）的水榕液，用1mol/LNaOH调pH值

至6.7～6.轧过滤后4℃下保存备用。

A.5.21%(10g/L）醋酸铀负染色液

低盐的病毒提纯试样也可用1%(10g/L)酣酸铀水榕液进行负染色，具有更高的罔像分辨率。称

取0.5g醋酸铀，用50mL双蒸馆水配制成醋酸铀负染色液，呈淡黄色，pH值4.2，室泪下避光保存

备用。

A.5.32%(20g/L）锢酸接负染色液

称取1.0g铝酸妓，用50mL双蒸馆水配制成2%(20g/L）的水榕液，用乙酸镀调pH值至7.0～

7.2，过滤后4℃下保存备用。

9

时＼目。

0

φomω

附录B

（资料性附录）

∞

｜

植物病毒各科、属的形态学和细胞病理学特征

ON

根据国际病毒分类委员会2016年发布的病毒分类第十次报告，植物病毒涉及4个目、26个科、5个亚科、118个屈，共有1323种。不同病毒具有∞－

各向特定的粒子形态和细胞病理学特征，可以作为病毒检测鉴定的形态学依据（见表B.l）。

表B.1

植物病毒各科、属的形态学和细胞病理学特征

基肉组大小

Fl科或未归类属包膜病毒形态革豆子大小基因组片段细胞病理学特征

(kbp或kb)

ssDNA病毒

双生病毒手：↓1个或2个环状2.5／每片段～

22nm×38nm

双联二卡面体病毒在例皮部组织的细胞核中积累

(,>mimv门’idu俨片段3／每片段

无移动蛋白

20nm2.17

类双丘f:.病毒科二十面体1个环状片段不详

(,e11omrru111dα俨

6个或8个环状0.98／得片段～

矮缩病毒科

18nm~20nm

二，－面体

N1111ovirid11"’病毒粒子散布在感病叶片的细胞质中

片段1.1／每片段

dsDNA-RT病毒

感病细胞内产生具小空胞的病毒基质，

二十面体50nm~52nm

病毒草豆子处在基质中或散布于细胞质；

花椰菜花叶病毒科二十面体、

仔l革i状30nm×130nm非共价的闭环状7.2~9.2杆状DNA病毒属桩子单个或成群分布

Caulimoviridα，，

杆’出｜状

最长至900nm

基因在细胞质；水稻东格鲁病毒存在于维管

束细织中

ssRNA-RT（十〉病毒

病毒样颖槌或具

转座病毒科50nm病毒样颗粒细胞JJ,J病毒样颗粒聚集状或单个分布，

4~10

十／但膜的胞外病毒1个线状片段

100nm具包膜桩子

1Vle111v,r":/"'’里不规则球形

和于

表B.1（续）

基因组大小

目

科或未归类属粒子大小基因组片段细胞病理学特征

包膜病毒形态

(kbp或kb)

病毒样颗桩有的位于细胞质中，有的在

伪病毒科

民贯状、二十面体30nm~40nm1个线状片段5~9

JJsr11dοv,ridu,,

细胞核内，形态卵圆形到球形

dsRNA病毒

病毒积累于薄壁组织或韧皮部组织的

I呼肠孤病毒科突起或光滑的二10个～12个线状细胞质中，产生大块病毒基质，未成熟

60nm~85nm总基因组19～32

Heov,ridae｜面体外壳片段颗粒处在病毒慕质中，细胞质中还形成

包含病毒粒子的豆英状结构

＇！；）／...分病毒科1.4／每片段～病毒存在于感州组织薄壁细胞的细胞

35nm~40nm

口｜－面体2个线状片段

F<1rt1tiv11id刷’

2.4／得片段质中，含景很低

由3.5kbp的单双

J由内组织中观察不到病毒粒子，只有蓝

混合病毒科

未知未知1个片段！顶反子dsRNA喝：i潜隐病毒能用原核表达的ORFl产

Amulf.(uvirid“是’