DB37/T 4092-2020 鱼类肠道微生物分离鉴定通用技术要求

ICS07.100

B50

DB37

山东省地方标准

DB37/T4092—2020

鱼类肠道微生物分离鉴定通用技术要求

Thegeneraltechnicalrequirementsofseparationandidentificationoffishintestinal

microorganism

2020-08-20发布2020-09-20实施

山东省市场监督管理局发布

DB37/T4092—2020

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由山东省海洋局提出并组织实施。

本标准由山东省海洋标准化技术委员会归口。

本标准负责起草单位：青岛华大基因研究院、青岛市标准化研究院。

本标准主要起草人：刘姗姗、乔雪松、王裕宽、王萌萌、杨恒加、王琛、陈建威、苏小珊、翟越、

许静、赵丹。

I

DB37/T4092—2020

鱼类肠道微生物分离鉴定通用技术要求

1范围

本标准规定了鱼类肠道微生物样本的采集、分离、培养、鉴定及保藏等。

本标准适用于淡水及海水鱼类肠道微生物的研究。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T30744深海微生物样品前处理技术规范

SN/T2632微生物菌种常规保藏技术规程

3术语与定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

肠道微生物intestinalmicroorganism

生长于动物肠道，并帮助宿主完成多种生理生化功能的微生物群落。

3.2

16SrDNA

是编码16SrRNA的基因，16SrRNA为核糖体RNA的一个亚基，是系统分类研究中最常用的分子标签，

可被用于菌种鉴定。

3.3

聚合酶链式反应polymerasechainreaction

一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA/RNA片段，这种方法可在生物体外进行，不必依赖大肠

杆菌或酵母菌等生物体。

3.4

Sanger测序Sangersequencing

即双脱氧链终止法测序，为第一代DNA测序技术，是一种常用的核酸测序技术，用于DNA分析，由英

国生物化学家弗雷德里克•桑格于1977年发明。

4缩略语

1

DB37/T4092—2020

下列缩略语适用于本文件。

PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSaline）

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

OD：光密度（OpticalDensity）

5基本要求

5.1实验室通用要求

实验室应满足GB19489中关于一级或以上级别生物安全实验室的要求。

5.2鱼类样本要求

鱼类样本应尽量保证鲜活，死亡鱼类样本最长死亡时间不应超过24h。

5.3实验用具准备

一次性无菌手套、无菌眼科镊、无菌眼科剪、无菌PBS（配方见附录A.1）、2216E培养基(配方见附

录A.2)、LB培养基（配方见附录A.3）、无菌水、无菌50mL离心管、医用托盘、75%消毒酒精、涂布棒

等。

6鱼类肠道微生物样本采集和保存

6.1鱼类肠道微生物样本采集与储存

6.1.1活体鱼类样本应先进行麻醉，之后，在超净工作台内，用75%的酒精对鱼体擦拭消毒。

6.1.2将鱼类样品从泄殖腔处沿腹部剖开，用无菌PBS冲洗鱼类腹部，用吸水纸擦拭腹腔。

6.1.3分离并剪下鱼类完整肠道，将肠道内容物全部挤到无菌离心管中，并将肠道内壁残留物轻刮于

离心管中。

6.1.4对肠道内容物进行称重，内容物总质量应控制在10g以下，按1g内容物加入3mL无菌PBS的

比例进行稀释，震荡混匀，得到肠道微生物样本。

6.2肠道微生物样本存储

肠道微生物样本应储存在2℃～8℃低温环境下，宜立即进行处理，保存期限不应超过一周。

7鱼类肠道可培养微生物的分离、培养及鉴定

7.1肠道微生物分离和纯化

7.1.1肠道微生物分离

7.1.1.1取100μL肠道微生物样本，用无菌PBS稀释到1000μL，制成10-1样品稀释液，震荡混匀，

备用。

7.1.1.2取100μL10-1样品稀释液，用无菌PBS稀释到1000μL，制成10-2样品稀释液，震荡混匀，

备用。

7.1.1.3按上述步骤依次稀释获得10-3、10-4的样品稀释液，震荡混匀，备用。

2

DB37/T4092—2020

7.1.1.4取10-2，10-3，10-4样品稀释液进行固体培养基平板涂布，涂布平板宜28℃恒温培养，培养时

间1～3天，每隔12h观察菌落生长状态。

7.1.2肠道微生物纯化

7.1.2.1观察涂布平板的生长情况及菌落形态特征，选择合适稀释度（约10～200个菌落）的平板挑

选菌落，选择不同形态的单菌落编号后划线，于28℃恒温培养12h～24h。

7.1.2.2观察划线培养菌落形态特征是否单一，对于形态结构不单一的平板继续挑单菌落并划线培养，

直至获得菌落形态特征一致的纯培养单菌，并填写《菌落形态特征统计表》，参见附录B。

7.2肠道微生物培养

挑取分离、纯化出的纯培养单菌落接种至液体培养基中，宜150rpm28℃条件下恒温震荡培养至菌

液OD600值达到0.6～1.0之间。

7.3肠道微生物鉴定

7.3.1微生物基因组提取

对培养得到的菌液进行基因组提取，参照GB/T30744内相关内容进行。

7.3.2基因组16SrDNA基因扩增

对所提取菌株基因组的16SrDNA基因进行PCR扩增，扩增引物及反应条件详见附录C。

7.3.3PCR产物电泳检测

对扩增所得PCR产物进行电泳检测，步骤参见附录D。

7.3.4PCR产物测序及序列比对

对检测合格的PCR产物进行Sanger测序，测序结果与EzBioCloud数据库进行序列比对，确定分离微

生物的种类并参考附录E的信息记录表进行记录。

7.3.5其他情况

对于测序比对没有结果的菌株，可进行生化鉴定，包括镜检、革兰氏染色、接触酶试验、氧化酶试

验等，根据实验结果鉴定菌株种属类别。

8鱼类肠道微生物的保藏

8.1肠道微生物保藏

菌种保藏参见SN/T2632规范内容。

8.2保藏微生物信息记录

参照附录E的信息记录表，对保藏信息进行记录。

3

DB37/T4092—2020

AA

附录A

（规范性附录）

缓冲液及培养基配方

表A.1给出PBS配方。

表A.1PBS配方

NaCl8g

KCl