DB15/T 2784-2022 食用向日葵品种鉴定 SNP标记法

ICS67.050

CCSX04

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T2784—2022

食用向日葵品种鉴定SNP标记法

Varietalverificationoftheconfectionsunflower(Helianthusannuus

L.)SNPmarkertechnology

2022-08-30发布2022-09-30实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T2784—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC20）归口。

本文件起草单位：三瑞农业科技股份有限公司、华智生物技术有限公司、内蒙古自治区质量和标准

化研究院。

本文件主要起草人：JIUHUANFENG(冯九焕)、常敏、唐顺学、陈海军、田冰川、涂伟伟、霍治军、

李乐、安燕珂、魏志恒、张耀、侯敏、张龙梅。

I

DB15/T2784—2022

食用向日葵品种鉴定SNP标记法

1范围

本文件规定了利用单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphism,SNP）分子标记进行食用向

日葵（HelianthusannuusL.）品种鉴定的术语和定义、原理、仪器设备及耗材、试剂及溶液配制、检

测程序与方法、数据采集和记录、真实性验证、鉴定结果报告等要求。

本文件适用于食用向日葵的品种鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定

GB4407.2经济作物种子第2部分：油料类

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

品种鉴定varietyverification

判定及验证供检品种与对照品种是否为相同品种。

单核苷酸多态性singlenucleotidepolymorphism（SNP）

基因组中基于单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。

竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应kompetitiveallelespecificPCR（KASP）

通过引物末端特异性碱基竞争性匹配DNA模板实现SNP基因型分型的聚合酶链式反应。

推荐标记recommendedmarkers

能够最大程度地将供检品种与对照品种区分开来的优先选用的一组标记。

1

DB15/T2784—2022

基因型分型genotyping

通过检测方法确定某品种（或遗传材料）的基因、DNA区段或遗传标记的基因型。

4原理

不同向日葵品种的基因组间存在核苷酸序列差异，其中单核苷酸（A、C、G、T）多态性(SNP)在基

因组内分布广泛、密度高，这种差异可以通过荧光标记的KASP基因型分型等技术进行检测。

利用一套多态性高、稳定性好、品种区别力强、具良好基因型分型质量的推荐标记，检测供检样

品与对照样品之间的SNP差异位点数目，从而判定及验证供检样品的品种真实性。

5仪器设备及耗材

所需仪器设备及耗材为：

——实时荧光定量PCR仪、全自动样品快速研磨仪、高速离心机、核酸浓度测定仪、微孔板离心

机、微量移液器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、酸度计、磁力搅拌器、电子天平、冰箱等；

——微量离心管、普通枪头、384孔PCR板（白色）、封板膜、钢珠等。

6试剂及溶液配制

试剂要求

6.1.1所用试剂至少为分析纯或分子生物学纯。试剂配制用水应符合GB/T6682规定的一级水要求。

6.1.2十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA•2H2O）、三羟基甲基氨基甲烷（Tris-

base）、三氯甲烷、异丙醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、乙醇、PCRMasterMix

等。

溶液配制

6.2.10.5mol/LEDTA溶液（pH8.0）：称取186.1gNa2EDTA•2H2O，溶于800mL水中，加入固体

NaOH（约20g）调pH至8.0，定容至1000mL，高压灭菌。

6.2.21.0mol/LTris-HCl(pH8.0)：称取60.55gTris碱，溶于400mL水中，用HCl调pH至

8.0，定容至500mL，高压灭菌。

6.2.32×CTAB提取液：分别称取20gCTAB和81.7gNaCl，加水溶解，分别加入40mL0.5mol/L

EDTA溶液（pH8.0）、100mL1.0mol/LTris-HCl(pH8.0)，加水定容至1000mL，高压灭菌。使用

时，按2%（M/V）加入聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP-K30）。

6.2.42×KASPMasterMix：包括TaqDNA聚合酶、通用荧光引物、dNTP、镁离子、ROX内参荧光染料。

6.2.5KASP引物：包括10µMPrimer_AlleleX、10µMPrimer_AlleleY、10µMPrimer_AlleleC。

7检测程序与方法

样品要求

供检样品与对照样品应符合下列要求：

2

DB15/T2784—2022

——供检样品和对照样品可以为幼叶或种子；

——供检样品与对照样品为种子时，样品的取样、分样应符合GB/T3543.2的规定；

——供检样品与对照样品为种子时，样品的纯度应符合GB4407.2的规定；

——供检样品允许采用混合样检测或单株检测。混合样制备应至少来源于30个个体，单株检测

应不少于30个个体。

DNA提取

本文件推荐采用CTAB法提取DNA，其它能满足PCR扩增质量要求的提取方法均可适用。具体操作如下：

a)采集供检及对照样品的种子或幼嫩组织200mg～300mg，置于2.0mL离心管，放入4mm钢

珠，用全自动样品快速研磨仪于50Hz振动50s，重复2～3次，使叶片充分打碎；

b)加入600μL于65℃预热的CTAB提取液，65℃温浴60min，期间颠倒混匀多次；

c)加入等体积的三氯甲烷，颠倒混匀3min，于12000rpm离心10min；

d)取上清液450mL于新的1.5mL离心管，加0.6倍体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，12000rpm

离心5min，弃去上清液；

e)用300μL70%乙醇溶液洗涤2遍，自然干燥后，加200μLddH2O充分溶解DNA；

f)检测DNA浓度并稀释至25ng/μL～50ng/μL，置于4℃保存备用。

PCR检测

7.3.1总则

配制反应体系时，应同时设置1～2个无DNA模板的阴性对照（NTC）。根据NTC信号强弱，判断最适

扩增循环数。若NTC信号过高，与其它基因型掺杂，则应降低扩增循环数。

7.3.2推荐标记

标记选择的基本原则是：遗传多态性高、基因组上分布均匀、基因型分型质量好、重复稳定性好等。

本文件采用的SNP推荐标记及KASP引物序列见附录A。

7.3.3实时荧光定量PCR反应体系

本文件推荐以下PCR扩增反应体系（见表1），其中2×KASPMasterMix含有dNTP、TaqDNA聚合酶、

通用荧光引物及ROX荧光内参等。

其它兼容KASP的SNP检测体系均适用于本文件。依据PCR缓冲液类型、微孔板类型及检测平台，试验

条件可做相应调整。

表1PCR扩增反应体系

成份原浓度终浓度推荐用量（μL）

DNA25ng/μL～50ng/μL7.5ng/μL～15ng/μL1.20

2×KASPMasterMix2×1×2.00

Primer_AlleleX10μM0.15μM0.06

Primer_AlleleY10μM0.15μM0.06

Primer_C10μM0.40μM0.16

ddH2O--0.52

总体积--4.00

7.3.4实时荧光定量PCR反应程序

3

DB15/T2784—2022

荧光定量PCR反应按照下列程序进行：

a)预变性：94℃预变性15min；

b)梯度PCR：94℃变性20s，65℃（每循环降低0.8℃），退火和延伸60s，10个循环；

c)扩增：94℃变性20s，57℃退火和延伸60s，荧光信号读取，30个循环。

注：以上为推荐的基于实时荧光定量PCR仪检测平台的操作程序和参考条件，其他如GenomicsSNPLine、ArrayTape、

IntclliQube、微流控SNP芯片等利用KASP方法实现基因分型的检测平台同样适用于本文件。

8数据采集和记录

采用实时荧光定量PCR仪提供的数据分析软件，对每个标记产生的SNP荧光信号和基因型分型值

进行分析。

按照分型明确、NTC(无样品阴性对照)无特异性扩增的原则，保留或剔除该标记位点的数据。若一

个样品的缺失标记位点数占比大于等于5%，则不予采用，需重做。

数据记录为X/Y，其中X、Y为同一位点上两个不同的等位变异，即纯合基因型记录为XX或YY，

杂合基因型记录为XY；缺失位点记录为-/-。

9真实性验证

根据供检样品与对照样品在96个推荐标记中的差异位点数，进行品种真实性验证。

实际检测中，允许首先采用48个随机挑选的标记进行检测，若出现大于5个以上的异型个体，可

终止检测，进行结果判定。

具体鉴定意见参考以下规则：

——当差异位点数大于等于5个时，排除两者为同一品种；

——当差异位点数大于等于1且小于等于4个时，不确定两者为同一品种；

——当差异位数等于0个时，不排除两者属于同一品种。

注：对于有异议的样品，可按GB/T3543.5的规定进一步开展田间小区种植鉴定。

10鉴定结果报告

品种真实性验证结果可参考下列方式进行填报：

利用个SNP引物，采用平台进行检测，与对照样品相比，供检样品中共

检测出差异位点数个，差异位点的SNP标记编号为，鉴定意见为。

4

DB15/T2784—2022

A

A

附录A