GB/T 35024-2018 常见畜禽动物成分检测方法 液相芯片法

ICS67.120.10

B40

国

中华人民共和国国家标准

GB/T35024-2018

常见畜禽动物成分检测方法

液相芯片法

Detectionmethodofmammalsandpoultryingredients-

Suspendedbeadarray

2018-05-14发布2018-12-01实施

国家市场监督管理总局啦告

中国国家标准化管理委员会保叩

GB/T35024-2018

目lj昌

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由全国生物芯片标准化技术委员会（SAC/TC421）提出并归口。

本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共

和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：陈颖、吴亚君、杨艳歌、韩建勋、刘鸣畅、王斌、黄文胜、曹际娟、王姆、张舒亚、

高宏伟。

I

GB/T35024-2018

常见畜禽动物成分检测方法

液相芯片法

1范围

本标准规定了畜禽产品中常见动物物种成分的液相芯片检测方法。

本标准适用于肉及加工品、乳、皮张、内脏、动物饲料等畜禽产品中哺乳动物和反鱼动物成分，和13

种常见肉品或掺杂成分（骆驼、马、驴、艳牛、水牛、狗、猪、马鹿、羊、鸡、鸭、大鼠、小鼠）动物物种成分的定

性检测。方法的最低检出限为（质量百分比）：水牛5%，哺乳、反鱼、狗、羊、鸡、大鼠、小融为1%，骆驼、

艳牛、马鹿、猪、马、驴、鸭的最低检测限为0.1%。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T14699.1饲料采样

GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测

SN/T3561国境口岸卫生监督食品采样、送样规程

3术语和定义、缩略语

3.1术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1.1

1在相芯片技术suspendedbeadarray

通过掖相杂交将偶联有探针的做球与样品中靶基因序列结合，通过流式细胞技术对样品中的多种

目标成分进行同时检测。

3.1.2

｝在相芯片探针suspendedarrayprobe

固定于微球表面，能与目标成分亲和结合用于探测目标成分信息的核酸或蛋白分子。

3.1.3

质控探针qualitycontrolprobe

用来监控芯片反应是否正常的探针。

注：本标准使用的是人工合成的一段寡核昔酸探针（polyT20poly八20'5’端氨基标记）。

3.1.4

荧光强度中位值medianfluoresenceintensity

液相芯片检测仪检测到的样品荧光信号值，即软件自动读取与样品结合的微球数量，并进行背景值

校正后得到的数值。

GB/T35024-2018

3.1.5

闻值cutoffvalue

判定阳性信号的最低荧光强度中位值。通过实验数据统计分析后得出，要求防止假阳性结果，同时

保证灵敏度需求。

3.2缩略语

下列缩略语适用于本文件。

CTAB：才．六皖基三甲基澳化镀（cctyltr

DNA：脱氧核糖核酸（dcoxyribonuleicacid)

dATP：脱氧腺昔三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate)

dCTP：脱氧胞昔三磷酸（dcoxycytidinetriphosphatc)

dGTP：脱氧鸟昔三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate)

dTTP：脱氧胸昔三磷酸（deoxythymidinetriphosphate)

EDC:1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳化工亚胶盐酸盐［N-(3-dimethylar丑inodipropyl)-N'-ethylcar-

bodiimade]

EDTA：乙二胶四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid)

MES:2－吗l淋乙硕酸［2-(N-morpholino)-cthanesulfonicacid]

SA-PE：链莓亲和素－碟红素（streptavidin-phycoerythrobilin)

SDS：十二皖基硫酸铀（sodiumdodecylsulfate)

T正UJ：水生栖热菌（ThPrm11sα＜］IIαticu)

TE：由Tris和EDTA配制而成的缓冲珞液（Tris-EDTAbuffersolution)

TMAC：四甲基氯化镀（tctramcthylammoniumchloride)

Tris：三（捏甲基）氨基甲；皖［tris(hydroxymethyl)aminomethane]

4方法提要

对样品中的靶基因进行PCR扩增，通过液相杂交将偶联探针的微球与PCR扩增产物结合，采用流

式细胞技术对目标成分进行检测。每一种带有独特色彩编号的微球固定一种探针，特异结合一种目标

核酸序列。该核酸序列连接荧光标记物。单个的微球通过检测通道时被两束不同波长激光检测，一束

激光检测微球的色标编码，另一柬激光检测目标核酸序列荧光标记物。检测单一成分时，将该成分

PCR产物与相应做球进行反应；检测多种成分时，可以将各个成分的PCR产物与微球混合物进行反

应。检测实验室需达到GB/T27403-2008的要求。

5检测用引物和探针

质控探针及检测用｜哺乳动物通用引物探针，反鱼动物通用引物探针，以及13种特异性引物和探针

序列参见附录A中表A.l。

6试剂

6.1T叫DNA聚合酶。

6.210×PCR缓冲液。

6.3dNTPs(dATP、dCTP、dGTP、dTTP）。

6.4琼脂糖。

2

GB/T35024-2018

6.51真化乙链。

6.6酣。

6.7三氯甲炕。

6.8异丙醇。

6.9元水乙醉。

6.10异戊醉。

6.11分子量标准品（最小片段注20忡，最大片段《2000bp）。

6.12TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl,pH8.0,1mmol/LEDTA）。

6.13电泳缓冲液(10×TBE:Tris54g，棚酸27.5g,20mL0.5mol/LEDTA•Tr阶HCl,pH8.0，加水

至1000mL;50×TAE:Tris242g,100mL0.5mol/LEDTA,pH8.0，冰乙酸，57.1mL，加水至1L)。

6.14加样缓冲液（0.25%澳盼蓝，40%］曰：糖水溶液）。

6.15非磁性微球（微球直径5.6/.1.ffi，竣基修饰，按比例掺入660nm和730nm两种分类荧光染色，每

种荧光有10种故度，根据比例不同可以把球型基质分类为100种）。

6.160.1mol/LMES溶液。

6.17EDC溶液(10mg/mL)。

6.180.02%Twe巳n-20。

6.190.1%SDS。

6.20SA-PE溶液。

6.21TMAC溶液（5mol/LTMAC,20%N－月桂毗肌氨酸，1mol/LTris-HCl,pH8.0,0.5mol/L

EDTA,pH8.0）。

6.22口AB提取液（20g/LCTAB,1.4日101/LNι0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/LNa2EDTA,pH8.0）。

6.23除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T6682中二级水的要求。

7仪器设备

7.1PCR仪。

7.2液相芯片仪。

7.3恒温箱。

7.4离心机：离心力15000g。

7.5微量移液器：0.51.1.L~10µL,10µL~100µL,20µL~2001.1.L,200µL~1000µLo

7.6核酸蛋白分析仪。

7.7天平：感量0.01mgo

8样晶采集与制备

8.1样品采集与前处理

果样、送样要求应符合GB/T14699.1和SN/T3561的规定。按照8.1～8.