GB/T 21312-2007 动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法

ICS67.120

X04

中华人民共和国国家标准

GB/T21312—2007

动物源性食品中14种隆诺酮药物残留

检测方法液相色谱■质/质谱法

Analysisoffourteenquinolonesinfoodofanimaloriginby

highperformanceliquidchromatographytandemmass

spectrometry

2007-10-29发布2008-04-01实施

发布

GB/T21312—2007

本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E均为资料性附录。

本标准由中国国家标准化管理委员会提出并归口。

本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、北京市疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心营

养与食品安全所。

本标准主要起草人:杨奕、国伟、吴永宁、彭涛、邵兵、李晓娟、代汉慧。

本标准首次发布。

T

GB/T21312—2007

动物源性食品中14种瞳诺酮药物残留

检测方法液相色谱■质/质谱法

1范围

本标准规定了动物源性食品中14种唾诺酮药物残留量检测的制样方法和高效液相色谱-质/质

谱检测方法。

本标准适用于猪肉、猪肝、猪肾、牛奶、鸡蛋等动物源性食品中恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙

沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、依诺沙星、洛美沙星、毗哌酸、荼睫酸、奥索利酸、氟甲座、西诺沙星、单诺沙星

14种唾诺酮类兽药残留量的液相色谱-质/质谱法测定和确证。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有

的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究

是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682—1992,ncqISO3696：1987)

3方法提要

用0.lmol/LEDTA-Mcllvaine缓冲液(pH4.0)提取样品中的唾诺酮类抗生素，经过滤和离心后，

上清液经HLB固相萃取柱净化。高效液相色谱-质/质谱测定,用阴性样品基质加标外标法定量。

4制样方法

制样操作过程中应防止样品受到污染或残留物含量发生变化。

4.1动物肌肉和动物内脏

将现场采集的样品放入小型冷冻箱中运输到实验室，在一10°C以下保存，一周内进行处理。取适量

新鲜或冷冻解冻的动物组织样品去筋、捣碎均匀。

4.2牛奶

将现场采集的样品放入小型冷冻箱中运输到实验室，在一10°C以下保存，一周内进行处理。取适量

新鲜或冷冻解冻的样品混合均匀。

4.3鸡蛋

将现场采集的样品放入小型冷冻箱中运输到实验室，在一10°C以下保存，一周内进行处理。取适量

新鲜的样品，去壳后混合均匀。

5试剂和材料

除特殊注明外，本法所用试剂均为色谱纯，水为GB/T6682规定的一级水。

5.1柠檬酸:分析纯。

5.2磷酸氢二钠：分析纯。

5.3甲醇。

5.4乙睛。

5.5甲醇-乙月青溶液：40+60(体积比)。

1

GB/T21312—2007

5.6甲酸(99%)。

5.7氢氧化钠：分析纯。

5.8乙二胺四乙酸二钠：分析纯。

5.9磷酸氢二钠溶液：0.2mol/Lo称取71.63g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至1000mL。

5.10柠檬酸溶液：0.1mol/L0称取21.01g柠檬酸，用水溶解,定容至1000mL。

5.11Mcllvaine缓冲溶液:将1000mL0.1mol/L柠檬酸溶液(5.10)与625mL0.2mol/L磷酸氢二

钠溶液(5.9)混合，必要时用盐酸或氢氧化钠调节pH至4.0+0.05。

5.12EDTA-Mcllvaine缓冲溶液：0.1mol/L0称取60.5g乙二胺四乙酸二钠(5.8)放入1625mL

Mcllvaine缓冲溶液(5.11)中，振摇使其溶解。

5.13甲醇水溶液：5%(体积分数)。

5.14甲酸水溶液：0.2%(体积分数)。

5.15嗟诺酮类药物标准物质：恩诺沙星(enrofloxacin,CAS：93106-60-6)、诺氟沙星(norfloxacin,

CAS：70458-96-7)、培氟沙星(pefloxacin,CAS：6159-55-3)、环丙沙星(ciprofloxacin,CAS：85721-33-1)、

氧氟沙星(oflaxacin,CAS:82419-36-1)、沙拉沙星(sara£loxacin,CAS：98105-99-8)、依诺沙星(enoxacin,

CAS：74011-58-8),洛美沙星(lomefloxacin,CAS：98079-51-7),毗哌酸(pipcmdilicacid,CAS：51940-44-4)、

蔡睫酸(nalidixicacid,CAS：389-08-2)、奥索利酸(oxolinicacid,CAS：14698-29-4)、氟甲^(flumequine,

CAS：42835-25-6)、西诺沙星(cinoxacin,CAS：28657-80-9)、单诺沙星(danofloxacin,CAS:74011-58-8)

(纯度>99%)。

5.16标准溶液

5.16.1标准储备液:分别称取0.0100g标准品(5.15)置于10.0mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定

容至刻度，标准储备液浓度为1mg/mL,-20°C冰箱中保存,有效期3个月。

5.16.2标准工作液:将以上各标准储备液(5.16.1)稀释,配成混合标准溶液。各组分浓度为10yg/mL。

此标准工作液于4C保存，可保存3个月°

5.17HLB固相萃取柱(200mg,6mL)或其他等效柱。

6仪器

6.1高效液相色谱-串联质谱仪。

6.2电子天平：感量0.0001g0

6.3电子天平：感量0.01g0

6.4组织匀浆机。

6.5旋涡混合器。

6.6冷冻离心机(最高转速大于1000r/min)o

6.7聚丙烯离心管(50mL)。

6.8酸度计(0.01)o

6.9氮吹仪。

6.10固相萃取仪。

7提取及净化

7.1提取

7.1.1动物肌肉组织、肝脏、肾脏

称取均质试样5.0g(精确到0.1g),置于50mL聚丙烯离心管中，加入20mL0.1mol/LEDTA-

Mcllvaine缓冲溶液(5.12),1000r/min旋涡混合1min,超声提取10min,10000r/min离心5min(温

度低于5°C),提取三次,合并上清液。

2

GB/T21312—2007

7.1.2牛奶和鸡蛋

称取均质试样5.0g(精确到0.01g),置于50mL聚丙烯离心管中，用40mL0.lmol/LEDTA-

Mcllvaine缓冲溶液(5.12)溶解，1000r/min旋涡混合1min,超声提取10min,10000r/min离心

10min(温度低于5°C),取上清液。

7.2净化

HLB固相萃取柱(200mg,6mL)，使用时用6mL甲醇洗涤、6mL水活化。将7.1提取的溶液以

2mL/min~3mL/min的速度过柱，弃去滤液，用2mL5%甲醇水溶液(5.13)淋洗，弃去淋洗液，将小柱

抽干，再用6mL甲醇洗脱并收集洗脱液。洗脱液用氮气吹干，用1mL0.2%甲酸水溶液(5.14)溶解，

1000r/min旋涡混合1min,用于上机测定。

7.3基质加标标准工作曲线的制备

将混合标准工作液(5.16.2)用初始流动相逐级稀释成2.5卩g/L〜100.0g/L的标准系列溶液。

称取与试样基质相应的阴性样品5.0g,加入标准系列溶液1.0mL,按照7.1、7.2与试样同时进行提取

和净化。

8高效液相色谱-质/质谱测定

&1高效液相色谱条件

&1.1色谱柱：WatersACQUITYUPLC™BEHS柱(100mmX2.1mm,l.7“n)或其他等效柱。

&1.2流动相：A[40+60甲醇-乙月青溶液(5.5)]；B[0.2%甲酸水溶液(5.14)]梯度淋洗,参考梯度条件

见表B.1。

8.1.3流速：0.2mL/mino

&1.4柱温：40°C。

8.1.5进样体积：20"。

&2质谱条件

电离模式：电喷雾电离正离子模式(ESI+)；质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；分辨率：单位分辨

率;其他参考质谱条件见附录A。

9空白试验

除不加标准外，均按上述步骤进行测定。

10结果计算与表述

10.1定性标准

10.1.1保留时间

试样中目标化合物色谱峰的保留吋间与相应标准色谱峰的保留吋间相比较，变化范围应在土2.5%

之内，参考保留吋间见表B.2。

10.1.2信噪比

待测化合物的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3(S/N$3),定量离子的重构离子

色谱峰的信噪比应大于等于10(S/N>10)o

10.1.3定量离子、定性离子及子离子丰度比

每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，

对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差

不超过表1规定的范围。各化合物的参考质谱图和标准溶液色谱图见附录C,附录D。

3

GB/T21312—2007

表1定性时相对离子丰度的最大允许偏差

相对离子丰度>50%>20%〜50%>10%〜20%<10%

允许相对偏差±20%±25%±30%±50%

10.2结果计算与表述

按式（1）计算座诺酮类药物残留量。

V_eVX1000/1、

X~mx1000（）

式中：

X——样品中待测组分的含量，单位为微克每千克（pig/kg）；

C——测定液中待测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

V——定容体积，单位为毫升（mL）；

样品称样量，单位为克（g）。

11检出限、定量限与回收率

11.1检出限

动物组织中检出限（S/N=3）：氟甲座、蔡喘酸、奥索利酸、西诺沙星、恩诺沙星、单诺沙星、洛美沙

星、氧氟沙星均为1.0g/kg,环丙沙星为2.5g/kg,沙拉沙星、诺氟沙星、培氟沙星、毗哌酸为2.0g/kg,

依诺沙星为3.0“g/kg。

鸡蛋和牛奶中检出限:氟甲座、荼喘酸、奥索利酸、西诺沙星、恩诺沙星、单诺沙星、洛美沙星、氧氟沙

星均为0.5隅/kg,环丙沙星为1.2g/kg,沙拉沙星、诺氟沙星、培氟沙星、毗哌酸为1.0g/kg,依诺沙

星为1.5Fg/kg。

11.2定量限

动物组织中定量限（S/N=1O）：氟甲唾、蔡喘酸、奥索利酸、西诺沙星、恩诺沙星、单诺沙星、洛美沙

星、氧氟沙星均为3.0g/kg,环丙沙星为8；zg/kg,沙拉沙星、诺氟沙星、培氟沙星、毗哌酸为6g/kg,

依诺沙星为10“g/kg。

鸡蛋和牛奶中定量限:氟甲座、荼喘酸、奥索利酸、西诺沙星、恩诺沙星、单诺沙星、洛美沙星、氧氟沙

星均为2g/kg,环丙沙星为4g/kg,沙拉沙星、诺氟沙星、培氟沙星、毗哌酸为3g/kg,依诺沙星

为5pig/kgo

11.3回收率

回收率试验采用三个加标浓度，分别为检出限浓度的1、2、5倍。猪肉中14种座诺酮的加标回收率

在86.8%〜116.9%之间，相对标准偏差（RSD）在1.9%〜15.1%之间；猪肝中14种隆诺酮的加标回收

率在90.2%〜11&5%之间，RSD在1.8%-14.1%之间；猪肾中14种座诺酮的加标回收率在

86.8%〜113.1%之间，RSD在2.3%〜17.0%之间；牛奶中14种嗟诺酮的加标回收率在79.0%〜

119.9%之间，RSD在2.2%〜19.4%之间；鸡蛋中14种座诺酮的加标回收率在80.5%〜112.1%之

间，RSD在2.9%〜20.1%之间。具体见附录E。

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附录A

（资料性附录）

参考质谱条件"

参考质谱条件：

a）电离源：电喷雾正离子模式；

b）毛细管电压：2.0kV；

c）射频透镜电压：OV；

d）源温度：110°C；

e）脱溶剂气温度：350°C；

f）脱溶剂气流量：5OOL/h；

g）电子倍增电压：650V；

h）喷撞室压力：0.28Pa；

i）其他质谱参数见表A.l0

表A.114种隆诺酮的主要参考质谱参数

化合物母离子子离子碰撞能量/eV锥孔电压/V

271.V2138

毗哌酸304.3

189.03238

290.3a1738

培氟沙星334.3

233.22538

31&3a1838

氧氟沙星362.2

261.22738

303.3a1950

依诺沙星321.4

233.92250

302.3a1950

诺氟沙星320.3

276.31750

314.3a1936

环丙沙星332.2

288.31736

316.01938

恩诺沙星360.3

342.32338

340.3a2538

单诺沙星358.3

82.04238

265.2"2336

洛美沙星352.3

30&31736

342.3a1840

沙拉沙星386.3

299.32840

1）所列质谱参考条件是在Micromass®-QuattroPremierXE质谱仪上完成的，此处所列试验用仪器型号仅供参

考，不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家或型号的仪器。

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表A.1（续）

化合物母离子子离子碰撞能量/eV锥孔电压/V

244.V1635

西诺沙星263.1

188.82835

244.r1650

奥索利酸262.1

155.92850

215.V1526

蔡碇酸