GB/T 18980-2003 乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法

ICS67.100.10

X04

GB/T18980-2003

乳和乳粉中黄曲霉毒素M,的测定

免疫亲和层析净化高效液相色谱法

和荧光光度法

DeterminationofaflatoxinM1contentinmilkandmilkpowder-

Cleanupbyimmunoaffinitychromatogaphyanddeterminationby

high-performanceliquidchromatigraphyandfluorometer

(ISO14501:1998，IDT)

2003-02-21发布2003-08-01实施

中华人民共和国

国家质量监督检验检疫总局发布

GB/T18980-2003

前言

本标准的免疫亲和层析净化一高效液相色谱法等同采用ISO14501;1998乳《和乳粉中黄曲霉毒素

M免疫亲和层析净化高效液相色谱法》。

本标准免疫亲和层析净化一荧光光度法快速测定乳和乳粉中黄曲霉毒素M,o

本标准中的附录A为资料性附录

本标准由北京市质量技术监督局提出。

本标准由全国食品工业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位:北京市产品质量监督检验所、青岛出人境检验检疫局、国家标准物质研究中心。

本标准主要起草人:王晶、张鹏、张艺兵、邵明武。

本标准为首次发布。

GB/T18980-2003

乳和乳粉中黄曲霉毒素M,的测定

免疫亲和层析净化高效液相色谱法

和荧光光度法

免疫亲和层析净化高效液相色谱法

1.1范围

本标准适用于乳、乳粉，以及低脂乳、脱脂乳、低脂乳粉和脱脂乳粉中黄曲霉毒素M,含量的测定。

乳粉中的最低检测限是。.08pg/kg，乳中的最低检测限是。.008pg/l

1.2术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

1.2.1

黄曲碑毒索M，含，at7atoxinM,content

通过本标准所测定出的本物质的质量含量。

注:黄曲霉毒素M、的含量以微克/升伽g/L)或微克/千克(fig/kg)表示。

1.3原理

试样通过免疫亲和柱时，黄曲霉毒素M被提取。亲和柱内含有的黄曲霉毒素M、特异性单克隆

抗体交联在固体支持物上，当样品通过亲和柱时，抗体选择性的与黄曲霉毒素M,(抗原)键合，形成抗

体一抗原复合体。用水洗柱除去柱内杂质，然后用洗脱剂洗脱吸附在柱上的黄曲霉毒素M,，收集洗脱

液。用带有荧光检测器的高效液相色谱仪测定洗脱液中黄曲霉毒素M,含量

1.4试荆

除非特别声明，所用试剂为分析纯;使用蒸馏水、去离子水或其他相当纯度的水。

1.4.1免疫亲和柱:应该含有黄曲霉毒素M的抗体。亲和柱的最大容量不小于100ng黄曲霉毒素

M,(相当于50ml浓度为2pg/l的试样)，当标准溶液含有4ng黄曲霉毒素M,(相当于50mL浓度为

80ng/l的试样)时回收率不低于80。应该定期检查亲和柱的柱效和回收率，对于每个批次的亲和柱

至少检查一次(见和)

柱效检查

用移液管((1.5.4)移取1.0m工_的黄曲霉毒素M,储备液(()到20mL的锥形试管中

(1.5.9)。用恒流的氮气(1.4.3)将液体慢慢吹干，然后用10ml.10%的乙睛()溶解残渣，用力

摇荡。

将该溶液加人到40mL的水中，充分混匀，全部通过免疫亲和柱。按说明书要求使用免疫亲和柱。

淋洗免疫亲和柱后，洗脱下黄曲霉毒素M,。将洗脱液进行适当稀释后，用高效液相色谱仪测定免疫亲

和柱键合的黄曲霉毒素M,含量。

计算黄曲霉毒素M,的回收率，将其结果与1.4.1中所要求的指标进行比较。

回收率检查

用移液管(1.5们移取。.8ml。005pg/ml的黄曲霉毒素Ml标准工作液(()到10mL的

水中，充分混匀，全部通过免疫亲和柱。按说明书使用免疫亲和柱。淋洗免疫亲和柱，洗脱下黄曲霉毒

素M:。将洗脱液进行适当稀释后，用高效液相色谱仪测定免疫亲和柱键合的黄曲霉毒素M，含量。计

GB/T18980-2003

算黄曲霉毒素M，的回收率，将其结果与1.4.1中所要求的指标进行对比。

1.4.2乙睛:色谱级

25%乙睛一水溶液:将250mL的乙睛(1.4.2)与750ml的水混溶(使用前需要脱气)。

10%乙睛一水溶液:将100mL的乙睛(1.4.2)与900mL的水混溶(使用前需要脱气)。

1.4.3氮气。

1.4.4三抓甲烷:加人。.5%^-1.0%质量比(与三抓甲烷质量比)的乙醇进行稳定。

1.4.5黄曲霉毒素M:标准溶液

校准溶液

黄曲霉毒素M:三抓甲烷溶液标称浓度为10pg/mL。根据下面的方法，在最大吸收波段处测定溶

液的吸光度，以确定黄曲霉毒素M,的实际浓度。

用分光光度计((1.5.11)在340nm^-370nm处测定，扣除三抓甲烷的空白本底，读取标准溶液的吸

光度值。在接近360nm最大吸收波段A、二处，测得吸光度值为A，根据式(1)计算出浓度值

c,(Pg/mL),

..

‘=AXMX100/e··································……(1)

式中:

A—在3m.:处测得的吸光度值;

M--328g/mol，黄曲霉毒素M,摩尔质量，单位为克每摩尔(g/mol);

E-1995,溶于三抓甲烷中的黄曲霉毒素M,的吸光系数，单位为平方米每摩尔(m'/mol),

标准储备液

确定黄曲霉毒素M;标准溶液的实际浓度值后((1.4.5.)1，继续用三抓甲烷将其稀释至浓度为

0.1ug/mI一的储备液。储备液密封后于冰箱中5℃以下避光保存。在此条件下，储备液可以稳定两个

月。两个月后，应该对储备液的稳定性进行核查。

黄曲霉毒素M,标准工作液

从冰箱中取出储备液(()放置至室温，移取一定量的储备液进行稀释制备成工作液。工作液

当天使用当天制备。

黄曲霉毒素M，标准工作液配制:用移液管(1.5.4)准确移取1.0mL的储备液(()到20mL

的锥形试管中((1.5.9)，用和缓的氮气((1.4.3)将溶液吹干，然后用20.0mL10%的乙睛()将残

渣重新溶解，30min内振摇、混匀，配成浓度为。.005jg/mI的黄曲霉毒素M;标准工作液。在用氮气

对储备液吹干的过程中，一定要仔细操作，不能让温度降低太多而出现结露。

在作标准曲线时，黄曲霉毒素M，的进样量分别为。.05ng,0.1ng,0.2ng和。.4ng。根据高效液

相色谱仪进样环的容积量，用工作液配制一系列适当浓度的黄曲霉毒素M,标准溶液，稀释液用10%乙

睛()

5仪骼及材料

便用实验室通用仪器设备，特殊仪器及材料说明如下

1,5.1一次性注射器:10mL和50mL,

1.5.2真空系统。

1.5.3离心机:4000g离心力(离心力g=1.12X10-,X转/分X旋转半径)。

1.5.4移液管:1.0mL,2.0ml和50.0ML,

1.5.5玻璃烧杯:250mLo

1.5.6容量瓶:100mLe

1.5.7水浴:温控30℃士2',50℃士20C,温度范围350C370C,

1.5.8滤纸

1.5.9带刻度的磨口锥形玻璃试管:5mL,