DB5301/T 26-2019 马铃薯品种真实性和种薯纯度鉴定 DNA分子标记

ICS65.020.01

B05

DB5301

昆明市地方标准

DB5301/T26—2019

代替DG5301/T26-2017

马铃薯品种真实性和种薯纯度鉴定

DNA分子标记

2019-12-01发布2019-12-01实施

昆明市市场监督管理局发布

DB5301/T26—2019

前  言

本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。

本标准由昆明市农业局提出并归口。

本标准起草单位：云南师范大学马铃薯科学研究院、昆明市农业科学研究院。

本标准主要起草人：唐唯、易靖、李灿辉、朱维贤、段晓艳、郝大海、刘卫民、邹万君、李华、

张仲平、李明富、张丽芳、蒋瑜、杨春利。

本标准代替了DG5301/T26-2017。

I

DB5301/T26—2019

马铃薯品种真实性和种薯纯度鉴定DNA分子标记

1范围

本标准规定了DNA分子标记鉴定马铃薯（SolanumtuberosumL.）品种的方法。

本标准适用于马铃薯品种真实性鉴定和种薯纯度检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于

本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB18133马铃薯种薯

GB/T28660马铃薯种薯真实性和纯度鉴定SSR分子标记

3术语和定义

GB/T28660和以下术语及定义适用于本文件。

3.1

简单序列重复

基因组中由1～6个核苷酸残基组成的基本单位串联多次重复构成的DNA序列。

[GB/T28660，定义3.1]

3.2

聚合酶链式反应

在耐热DNA聚合酶作用下，于体外快速大量特异性扩增特定DNA序列的方法。

[GB/T28660，定义3.2]

3.3

毛细管电泳

是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。

3.4

DNA分子标记

能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。

3.5

标准品种

按国家农作物品种审定标准认定的品种。

4仪器用具、试剂和软件

4.1仪器及用具

用本方法进行试验时，需要仪器、用具如下：

1

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——PCR仪（96孔，梯度）；

——低温高速离心机（4℃，16000rpm/min）；

——冰箱（-20℃，-80℃）；

——制冰机(200kg/天～300kg/天)；

——高压灭菌器（121℃，0.15MPa）；

——微量移液器（0.5μL～10μL、10μL～100μL、100μL～1000μL）及配套的枪头；

——凝胶成像仪；

——电泳仪；

——水平电泳槽；

——基因分析仪（GeneticAnalyzer,ABI3500/3730xl系列）；

——紫外可见分光光度计（190nm～1100nm）；

——0.2mLPCR管；

——96孔测序板；

——石英比色皿。

4.2试剂

用本方法进行试验时，需要试剂如下：

——常用贮备液（制备方法见附录A）；

——DNA提取试剂（制备方法见附录B）；

——DNA分子标记引物（见附录C）；

——TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）和配套的PCR缓冲液；

——1000bpDNAMarker；

——无DNA酶的RNA酶A（DNase-freeRNaseA）（10mg/mL）；

——异丙醇；

——乙醇（70%）；

——灭菌双蒸水（ddH2O）；

——甲酰胺（HIDI）；

——分子量内标（GeneScan500LIZ）；

——EB染液（100mL1×TAE+5μLEB染料）。

4.3软件

用本方法进行试验时，需要软件如下：

——DataCollection4.0（ABI）；

——GeneMarker2.09(ABI)；

——GeneMapper4.0(ABI)；

——MicrosoftExcel2013(Microsoftcorporation)。

5供试材料

5.1取样：按照GB18133取样所述方法进行，采集大田植株叶片或块茎作为检测样品。

5.2样品保存：选取适量样品，装入冻存管，液氮速冻，置冰箱（-80℃以下）中保存备用（有效保

存期小于等于6个月）。

2

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6鉴定程序

6.1总DNA提取

按下列顺序进行

a)称取100mg待测样品，置于预冷2.0mL离心管中，液氮冷冻下迅速研磨成细粉。

b)依次加入700μL的两倍十六烷基三甲基溴化铵缓冲液（CTAB缓冲液）（见附录B表B.1）和

2μL的β-巯基乙醇涡旋混匀。置65℃水浴1h，期间每隔10min摇动混匀一次。

c)冰上冷却约10min后，加入700μL的氯仿：异戊醇（24:1）混合液（见附录B表B.2），涡

旋混合,轻缓颠倒混匀数次。

d)12000rpm离心5min。吸取上层水相至新1.5mL离心管中，加入等体积（400μL～500μL）

的预冷异丙醇。轻缓颠倒混匀。

e)4℃冰箱静置30min后，12000rpm离心15min。弃上清液。

f)向离心管中加入70%乙醇1.0mL，静置3min后，12000rpm离心20min。

g)小心倒出70%乙醇，再加入90%乙醇1.0mL，静置5min后，12000rpm离心10min，小心

倒去乙醇。

h)在干净的吸水纸上倒置离心管，自然干燥15min。

i)晾干的DNA，应为透明状。加入100μL的1×TE缓冲液，将十倍三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四

乙酸缓冲液（EDTA缓冲液）（见附录B表B.3）稀释10倍并灭菌]溶解DNA，再加入2μL的

无DNA酶的RNA酶A（10mg/mL）。37℃温浴1h去除RNA。4℃冰箱放置备用。

6.2总DNA质量鉴定

6.2.1取DNA提取液1.0μL～5.0μL于新的1.5mL离心管中，加入1×TE缓冲液稀释至1.0mL，

混匀后转入石英比色皿中，用紫外分光光度计测定OD260和OD280下的光密度值（OD260：紫外光260nm下

的光密度值；OD280：紫外光280nm下的光密度值）。用OD260/OD280比值判断DNA纯度，比值在1.8～1.9

之间表明DNA纯度较高。按公式（1）计算提取液中DNA浓度。

OD260t50

dsDNA.................................................................(1)

1000

式中：

dsDNA——双链DNA分子的含量（μg/mL）；

OD260——紫外光260nm下的光密度值；

t——稀释倍数。

6.2.2总DNA浓度确定后，用1×TE缓冲液将所提取的总DNA稀释为终浓度50ng/μL，根据每次用

量分装，置-20℃冰箱保存备用。

6.3PCR反应

6.3.1PCR反应体系

在冰盘中或4℃条件下，按表1所列成分及其用量，顺序依次加入PCR管，准备25.0μLPCR

反应体系。

3

DB5301/26—2019

表1PCR反应体系

成分