DB32/T 3788-2020 梨枯梢病监测与检测技术规程

ICS65.020

B16

DB32

江苏省地方标准

DB32/T3788—2020

梨枯梢病监测与检测技术规程

TechnicalspecificationformonitoringanddetectionofShootBlightofAsianpear

2020-04-08发布2020-05-15实施

江苏省市场监督管理局发布

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由江苏省农业科学院提出并归口。

本标准起草单位：江苏省农业科学院。

本标准主要起草人：刘凤权、徐会永、赵杨扬、赵延存、孙伟波。

I

梨枯梢病监测与检测技术规程

1范围

本标准规定了梨枯梢病监测与检测的原理、试剂与材料、仪器与用具、监测技术、检测技术、结果

判定和报告、样品、菌种保藏和无害化处理、疫情处置等要求。

本标准适用于梨枯梢病田间监测以及苗木、砧木、接穗和果实上传带的梨枯梢病菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T2292亚洲梨火疫病监测技术规范

SN/T1157进出境植物苗木检疫规程

SN/T1193基因分析检测实验室技术要求

3原理

梨枯梢病，病原为亚洲梨火疫病菌（ErwiniapyrifoliaeKimetal.），是为害梨树的重要细菌病害之

一，属我国规定的检疫性有害生物。可以根据田间症状、菌落形态和培养特征、致病性、免疫学反应和

分子生物学特征等进行监测与检测。

4试剂与材料

检测中所需的所有试剂与培养基，参见附录A。

除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。试验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。

5仪器与用具

超净工作台、电子天平、磁力搅拌器、高压灭菌锅、培养箱、水浴锅、显微镜、高速台式离心机、

电泳仪、常规PCR仪、凝胶成像系统、冰箱、超低温冰箱、超纯水器、恒温干燥箱、恒温摇床、微量移

液器、制冰机等。

6监测技术

6.1监测植物

梨，主要监测亚洲梨。

1

6.2监测区域

重点监测亚洲梨集中种植区、引种繁育基地、苗木集散地等疫情发生高风险区。

6.3监测方法

6.3.1苗木监测

对从疫情发生区调运的苗木或疫区市场销售的苗木，按照SN/T1157要求进行抽样，并对样品进行

室内检测。

6.3.2田间监测

从梨树开花期开始，对当地农技员、果农等相关人员进行访问调查，并选择有代表性的梨园进行踏

查。重点观察田间有无梨枯梢病典型症状（见附录B），如发现可疑病株立刻进行标记、拍照并取样，

样品送实验室进行进一步检测鉴定。对梨园中梨枯梢疑似症状及其发生地点、发生时间、危害情况等信

息进行记录（见附录C）。

在疫情发生区，选择有代表性的梨园进行定点监测。从梨树开花期开始，每隔7d调查一次。采用5

点取样法，每点随机调查5株，统计或计算病株率和病梢率，并做好相关记录。监测过程中病梢的选取

按照NY/T2292中的规定执行。

7检测技术

7.1样品处理

选择表现典型症状并带有菌脓的植物部位如花朵、嫩梢、幼枝、叶片或幼果等，在无菌条件下切取

病健交界处组织约（3mm～5mm）×（3mm～5mm），表面消毒和清洗后，在装有适量无菌水的离心

管中轻轻挤压，浸泡10min～30min后制成样品悬浮液。或者直接挑取菌脓并用无菌水清洗后制成样品

悬浮液。悬浮液可用于其后的形态观察、免疫学和分子生物学检测等。

7.2检测方法

7.2.1显微镜检查

对于疑似症状的植物组织，切取病健交界处20mm2，平放在载玻片的水滴中，加盖玻片后，在低

倍显微镜下观察有无喷菌现象。

7.2.2培养特征检测

将样品悬浮液在YPDA培养基平板上划线或稀释分离，28℃倒置培养24h～72h。在YPDA培养基平

板上观察分离得到的细菌单菌落的形状、大小、颜色、光泽、隆起的形状、粘稠度、透明度、边缘特征

以及质地、水溶性色素等特征，观察并进行记录（参见附录B）。

7.2.3形态特征检测

按照常规染色方法，在显微镜下观察细菌菌体的形状、大小及排列情况、有无鞭毛及鞭毛着生的位

置和数目、是否产生荚膜和芽胞、芽胞着生的部位和形状、细胞内含物等特征。

7.2.4致病性测定

2

取梨幼果（直径大约3cm～5cm）洗净晾干，用灭菌刀片横切果实，置于垫有湿润的灭菌滤纸的培

养皿中。用无菌接种针蘸取培养24h～36h的菌落，针刺接种于幼果果肉组织，一个横切面接种3个～4

个点。接种后26℃保湿培养，24h后观察并记录接种部位有无坏死症状发生和菌脓形成。以无菌水为对

照。

7.2.5ELISA检测

挑取少量分离到的病原菌配制成108CFU/mL悬浮液进行ELISA检测，检测程序参见附录D。如采用

商品化ELISA方法进行检测，按照说明书进行操作及结果判定。

7.2.6PCR检测

挑取少量分离到的病原菌配制成108CFU/mL悬浮液，1mL菌悬液提取DNA后进行PCR检测，检测

程序见附录E。如采用市售的试剂盒，按说明操作。检测过程中防污染措施按照SN/T1193中的规定执行。

8结果判定和报告

8.1结果判定

8.1.1症状识别判定

田间梨树发病症状符合附录B描述的梨枯梢病典型症状，判断为梨枯梢病。

8.1.2常规检测结果判定

镜检有菌溢现象；分离物形态特征和培养特性与梨枯梢病菌相符（参见附录B）；致病性测定可在

接种部位产生高度隆起的乳白色菌脓，最后组织变褐坏死，但不发臭；能再次从接种发病部位分离到目

标病原菌，确定病原菌为梨枯梢病菌。

8.1.3ELISA检测结果判定

在阴性对照OD值≤0.1，且阳性对照OD值大于阴性对照OD值2倍的前提下，样品孔OD值大于阴性

对照OD值2倍时，判定为阳性反应，即样品