GB/T 8381.2-2005 饲料中志贺氏菌的检测方法

ICS65.120

B46遏日

中华人民共和国国家标准

GB/T8381.2-2005

饲料中志贺氏菌的检测方法

DeterminationofShigellainfeed

2005-09-05发布2006-02-01实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布

中国国家标准化管理委员会

GB/T8381.2-2005

月U舌

本标准参照采用GB/T4789.5《食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验》的有关内容。

本标准的附录A、附录B为规范性附录。

本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出。

本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位:国家饲料质量监督检验中心(北京)

本标准主要起草人:饶正华、李丽蓓、杨曙明、苏晓鸥。

GB/T8381.2-2005

饲料中志贺氏菌的检测方法

范围

本标准规定了饲料中志贺氏菌的检测方法。

本标准适用于饲料中志贺氏菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有

的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究

是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T14699.1饲料采样

3设备和材料

3.1天平:感量1g，最大称量1000g,

3.2均质器或乳钵。

3.3恒温培养箱。

3.4显微镜。

3.5灭菌广口瓶:500mL

3.6灭菌三角烧瓶:500mL,250mI。

3.7灭菌平皿:皿底直径90mme

3.8载玻片。

3.9酒精灯。

3.10灭菌金属匙或玻璃棒。

3.11接种棒，镍铬丝。

3.12试管架

3.13硝酸纤维素滤膜:150mmX50mm,00.45lim。临用时切成两张，每张70mmX50mm，用铅笔

划格，每格6mmX6mm。每行10格，分6行。灭菌备用。

4培养基和试荆

除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水(或去离子水，或相当纯度的水)。

4.1GN增菌液:见附录B的B.1章。

4.2HE琼脂:见附录B的B.2章。

4.3SS琼脂:见附录B的B.3章。

4.4麦康凯琼脂:见附录B的B.4章。

4.5伊红美蓝琼脂(EMB):见附录B的B.5章。

4.6三糖铁琼脂(TSD:见附录B的B.6章

4.7葡萄糖半固体管:见附录B的B.7章。

4.8半固体管:见附录B的B.8章。

4.9葡萄糖按琼脂:见附录B的B.9章。

4.10尿素琼脂(pH7.2):见附录B的B.10章。

GB/T8381.2-2005

4.11西蒙氏柠檬酸盐琼脂:见附录B的B.11章

4.12氰化钾(KCN)培养基:见附录B的B.12章。

4.13氨基酸脱狡酶试验培养基:赖氨酸、鸟氨酸及对照培养基，见附录B的B.13章。

4.14糖发酵管:棉子糖、甘露醇、甘油、七叶昔及水杨昔，见附录B的B.14章

4.155%乳糖发酵管:见附录B的B.15章。

4.16蛋白陈水、靛基质试剂:见附录B的B.16章。

4.17志贺氏菌属诊断血清

5试样的制备

进行微生物检验的饲料的采样和试样制备按G川T14699.1规定执行。实验室样品真实、具有代

表性在运输和贮存过程中没有发生损失或改变。

5.1采样应在无菌操作下进行。

5.2采样工具，如探子、铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，必须是灭菌的。

5.3根据样品种类如袋、瓶和罐装者，就取完整的未开封的。如果样品很大，则需用无菌采样器取样;

样品是固体粉末，应边取边混和;是流体的，通过振摇混匀;样品送到微生物检验室越快越好，一般应不

超过3h。如果路途遥远，可将试样于。0C^-5℃保存(如冰壶)。

6操作步骤(见附录A)

6.1增菌

称取饲料试料25g，加人装有225mLGN培养菌液(B.1)的500mL广口瓶((3.5)内，于360C培养

6h-v8h。培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应终止培养。

6.2分离和初步生化试验

6.2.1取增菌液I环，划线接种于HE琼脂(B.2)平板或SS琼脂(B.3)平板1个;另取1环划线接种

于麦康凯琼脂(B.4)平板或伊红美蓝琼脂(B.5)平板1个，于36℃培养18h--24h，志贺氏菌在这些培

养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。

6.2.2挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂(B.6)和葡萄糖半固体(B.7)各1管。一般应多挑几

个菌落，以防遗漏，经36℃培养18h-24h，分别观察结果

6.2.3出现下述现象的培养物可以视为阴性:

a)在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物;

b)在18h-24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物;

。)不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物;

d)产气的培养物;

e)有动力的培养物;

f)产生硫化氢的培养物

6.2.4凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌

株，可做血清学分型和进一步的生化试验

6.3血清学分型和进一步的生化试验

6.3.1血清学分型

挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用4种志贺氏菌多价血清(4.17)检查，如果由于

K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查;如果呈现凝集，则用Al,A2,B群多价和D群血

清分别试验如系H群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型

和群抗原见表1。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清

检查

GB/T8381.2-2005

4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1,2,3分别检查，并进一步用1-15各型因子

血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3-12型多价血清及各型因子血清检查。

表1福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原

在群因子血清中的凝集

型和亚型型抗原群抗原

3,467,8

1aI1,2,4,5,9··…+一一

IbI1,2,4,5,9++一

2au1,3，4…，+一一

2bII1,7，8，9··…一一+

3am1,6,7,8,9一千+

36皿1,3，4，份··…++一

4aIV1,(3,4)一+〔〕一一

46N1,3,4,斤++一

5aV1,3,十一+一一

56V1,5,7,9""一一+

6班1,2,(4)·一〔十〕一一

X变体1,7,8,9...一一十

Y变体1,3，小.+一一

注:+凝集;一不凝集;〕〔有或无.

6.3.2进一步的生化试验

在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即:葡萄糖按(B.9)，西蒙氏柠檬酸盐(B.11),赖

氨酸和鸟氨酸脱梭酶(B.13),pH7.2尿素(B.10),KCN生长(B,12)，以及水杨昔和七叶普的分解

(B_14)。除宋内氏菌和鲍氏13型为鸟氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。必要时还应

做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能

与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。

已判定为志贺氏菌属的培养物.应进一步做5%乳糖发酵(B.15)，甘露醇、棉子糖和甘油的发酵

(B.14)和靛基质试验(B.16)。志贺氏菌属4个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏6型

的生化特性与A群或C群相似，见表2。

表2志贺氏菌周四个群的生化特性

生化群5%乳糖甘露醇棉子糖甘油靛基质

A群痢疾志贺氏菌