DB22/T 396-2014 保健用品毒理学评价程序与检验方法

ICS11.020

C05

DB22

吉林省地方标准

DB22/T396—2014

代替DB22/T396-2004

保健用品毒理学评价程序与检验方法

Toxicologyassessmentprocedureandtestmethodsforhealthproduct

2014-05-04发布2014-06-01实施

吉林省质量技术监督局发布

DB22/T396—2014

目次

前言.................................................................................II

1范围...............................................................................1

2评价程序...........................................................................1

2.1评价阶段.......................................................................1

2.2评价阶段的选用原则.............................................................1

3检验方法...........................................................................2

3.1口腔保健用品毒性试验...........................................................2

3.2经皮保健用品毒性试验的试验方法.................................................7

3.3黏膜保健用品毒性试验的试验方法................................................13

3.4保健用品特殊毒性试验的试验方法................................................19

附录A（规范性附录）LD50计算方法...................................................28

附录B（规范性附录）实验动物体表面积估算方法.......................................31

I

DB22/T396—2014

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准代替DB22/T396-2004与原标准相比，主要技术变化如下：

——调整了口腔保健用品毒性试验，半数致死量测定中的大鼠体重，见3.1.1.1；

——调整了口腔保健用品毒性试验，半数致死量测定中的试验方法，见3.1.1.3；

——补充了经皮保健用品毒性试验，皮肤急性毒性试验中的受试物，见3.2.1.1.2；

——补充了经皮保健用品毒性试验，皮肤急性毒性试验中的皮肤准备，见3.2.1.2.1；

——补充了经皮保健用品毒性试验，皮肤急性毒性试验中受试物给予方法，见3.2.1.2.2；

——增加了经皮保健用品毒性试验，皮肤急性毒性试验中的剂量和分组，见3.2.1.2.3；

——调整了经皮保健用品毒性试验，皮肤刺激性试验中实验方法，见3.2.3.2.1；

——调整了黏膜保健用品毒性试验，眼刺激性试验中对受试物的相关要求，见3.3.1.1.2。

本标准由吉林省卫生与计划生育委员会提出并归口。

本标准起草单位：吉林省疾病预防控制中心。

本标准主要起草人：张琨、高峰、张晶莹、孟令仪、宋昕恬、吴晓刚、孙兰、隋自洁。

本标准所代替标准的历次版本发布情况为：

——DB22/T396-2004；

——DB22/T396-2014。

II

DB22/T396—2014

保健用品毒理学评价程序与检验方法

1范围

本标准规定了保健用品毒理学评价程序和检验方法。

本标准适用于保健用品毒理学评价检验方法。

2评价程序

2.1评价阶段

2.1.1第一阶段：急性毒性和皮肤、黏膜试验

2.1.1.1急性毒性试验包括下列试验：

a)经口急性毒性试验；

b)经皮急性毒性试验；

c)经皮急性毒性试验。

2.1.1.2皮肤、黏膜试验包括下列试验：

a)皮肤刺激性试验；

b)皮肤过敏试验；

c)眼刺激性试验；

d)鼻、阴道黏膜刺激试验。

2.1.2第二阶段：长期毒性和致突变试验

2.1.2.1长期毒性试验包括下列试验：

a)经口长期毒性试验；

b)经皮长期毒性试验。

2.1.2.2致突变试验包括下列试验：

a)鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）；

b)啮齿动物微核试验；

c)小鼠精子畸形试验；

d)哺乳动物培养细胞染色体畸变试验。

2.1.3第三阶段：致畸试验

2.1.4第四阶段：致癌试验

2.1.5第五阶段：人体皮肤斑贴试验

2.2评价阶段的选用原则

2.2.1保健用品的材料为常用原料，使用期限不超过二周者，仅进行第一阶段试验；使用期限二周或

超过二周者，需作第一和第二阶段的试验。

2.2.2保健用品材料中含有新材料者，需作第一、二阶段试验。

1

DB22/T396—2014

2.2.3保健用品的受试人群与妊娠或儿童有关，影响胎儿及子代发育，在长毒试验中发现对生殖系统

有毒性，以及在致突变试验中显示阳性结果者，需作第三阶段试验。

2.2.4保健用品在致突变试验中，有一项或一项以上试验为阳性者，需作第四阶段试验。如三项致突

变试验均为阴性结果，则可免作第四阶段试验。

2.2.5保健用品的材料中含可疑致敏原，以上试验均为阴性者，需作第五阶段试验。

2.2.6试验项目的选用见表1。

表1试验项目的选用

序号试验项目口腔保健用品经皮保健用品黏膜保健用品

1经口急性毒性试验十——

2经皮急性毒性试验—十—

3黏膜急性毒性试验——十

4皮肤刺激性试验—十—

5皮肤过敏试验—十十

6眼刺激性试验——十

7鼻、阴道黏膜刺激性试验——十

8经口长期毒性试验±——

9经皮长期毒性试验—±—

10Ames试验±±±

11啮齿动物微核试验±±±

12小鼠精子畸形试验±±±

13致畸试验±±±

15致癌试验±±±

16人体皮肤斑贴试验—±—

注1：＋为必做项目。

注2：－为免做项目。

注3：±按2.2项下的原则决定是否进行该项试验。

3检验方法

3.1口腔保健用品毒性试验

3.1.1半数致死量（LD50）的测定

3.1.1.1材料及条件

材料及条件包括：

a)动物：选用两种性别的成年小鼠和/或大鼠。雌雄各半，小鼠体重18g～22g，大鼠180g～

220g。动物购买后适应环境至少3h～5h。实验前，一般禁食约16h，不限制饮水；

b)受试物溶液的配制:常用蒸馏水或食用植物油为溶剂。若受试物是体积较小不溶于水或油的

粉末剂，可用0.5%羧甲基纤维素钠、10%阿拉伯胶、植物油制成混悬液。矿化容器类用其

盛放蒸馏水24h，取其盛放液备用，给受试物最大体积，小鼠不超过0.4ml/20gBW，大鼠

不超过2ml/100gBW；

c)给受试物途径：经口；

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d)环境条件：环境温度控制在20℃～25℃之间。

3.1.1.2剂量和分组

一般分为5个～6个剂量组。每组动物数10只，根据所选LD50计算方法而定。各剂量组间间距大小，

随受试物的毒性作用带宽窄而异。应先以较大组距和较少量动物进行预试验，找出其粗略致死剂量范围，

然后再确定试验的剂量分组。

3.1.1.3试验方法

正式试验时将动物称重，并随机分组，然后用特制的灌胃针头将受试物一次性给予试验动物。若

估计受试物毒性较低，一次给受试物容积太大，也可一日内多次给予（每次间隔4h～6h，24h内不

超过3次，尽可能达到最大剂量，合并作为一次剂量计算）。给予受试物后，密切观察动物反应情况，

每天观察一次，连续观察7d，逐日记录动物的一般状态、中毒表现和死亡情况见表2，并进行LD50的计

算，其方法见附录A。

表2动物的毒性反应

器官系统检查项目毒性表现

中枢和运动行为行为变化、不正常叫声、躁动不安或静伏少动

异常运动抽搐、震颤、共济失调、麻痹、局部肌肉抽动、强迫运动

神经系统对刺激的反应烦躁易怒、冷漠、感觉过敏、抑制状态

神经反射（含翻正反射）迟钝、丧失

植物神经系统瞳孔缩小、扩大

分泌物流涎、流泪

呼吸系统鼻分泌物

呼吸及其频率急促、过急、过慢、阵式呼吸、Kussmaul氏呼吸

心血管系统心前区触诊心室颤动、心动过缓、心律不齐、心搏过强或微弱

大便腹泻、便秘

胃肠系统腹部形态胀气、收缩

大便硬度、颜色不成形、黑便或土色便

泌尿生殖系统阴唇、乳腺肿胀

会阴部肮脏

皮肤和皮毛颜色、完整性充血、紫绀、苍白、竖毛、皮下松驰、发疹

眼眼睑下垂

眼球凸出、震颤、透明度降低

其他注射部位肿胀

一般状态异常姿态、消瘦等

3.1.1.4评价结果

评价试验结果时，应将LD50与观察到的毒性效应和尸检所见相结合考虑，LD50值是受试物毒性分级和

标签标识以及判定受试物经消化道摄入后引起动物死亡可能性大小的依据。引用LD50值时一定要注明实

验动物的种属、性别、染毒途径、观察期限等，评价应包括动物接触受试物与动物异常表现(包括行为

和临床改变、大体损伤、体重变化、致死效应与其它毒性作用)的发生率和严重程度之间的关系。根据

LD50数值，判定受试物的毒性分级见表3。

3

DB22/T396—2014

表3经口毒性分级

级别LD50（mg/kg）

极毒<1

剧毒≥1～50

中等毒≥50～500

低毒≥500～5000

实际无毒≥5000

3.1.2最大耐受量的测定

3.1.2.1材料及条件

按3.1.1.1要求进行。

3.1.2.2试验方法

3.1.2.2.1采用最大浓度下的最大容积，一次给予20只动物（雌雄各半）或一天内每隔4h～6h连

续2次～3次给予受试物，观察动物是否出现死亡，以不引起死亡的最大累计剂量作为最大耐受量。

3.1.2.2.2最大浓度，在灌胃时，以受试物的粘滞度能通过灌胃针头为准。若为液体型，为提高剂量，

也可适当浓缩，但由于渗透压、PH值等限制，也不宜浓度过大，以浓缩2倍～3倍为限。

3.1.2.2.3最大耐受量确定后，应推算出相当于临床给受试物日剂量的倍数。按式（1）计算。

mm

k=1×3.......................................(1)

m2m4

式中：

k——小鼠的最大耐受倍数；

m1——每只小鼠耐受受试物量，g；

m2——鼠平均体重，g；

m3——成人平均体重，60Kg；

m4——成人每日用量，g。

3.1.2.2.4毒性反应的观察方法、记录按3.1.1.3部分内容进行。

3.1.2.3结果评价

临床（实际应用）拟用剂量的100倍以上，为安全性限度。

3.1.3经口长期毒性试验方法

3.1.3.1材料

3.1.3.1.1动物

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SD或Wistar品系大鼠，试验周期在3个月之内的，用6周龄～8周龄大鼠；试验周期在3个月以上的，

用5周龄～6周龄大鼠。试验开始时，体重差异应在20%范围内，雌雄各半，按性别、体重随机区间分

组，使各组平均体重相似。各组动物数要相等，数量不少于20只。试验期限在三个月以上者每组数量应

增加到30只～40只。试验前至少观察一周，记录食量和体重。

3.1.3.1.2受试物

可以用原制剂，也可以用不含赋形剂的制剂。固体制剂灌胃时需以适当的溶媒溶解，不溶于水的可

再加1%左右羧甲基纤维素钠或10%左右阿拉伯胶助悬、植物油制成混悬液。临用前摇匀，避免混悬不匀

引起剂量误差。

3.1.3.2试验方法

3.1.3.2.1剂量组及对照组的设置

设三个或三个以上的剂量组。高剂量组应有少数动物出现严重毒性反应或死亡（不超过20%）；低

剂量组应相当或略高于功效学试验的有效剂量而不出现毒性反应；在高低两个剂量组之间再设一个中剂

量组，高、中、低三个剂量组宜以等比关系排列。

如采用不含赋形剂的制剂作为受试物，对照组可用水或其溶媒；如受试物采用含赋形剂的制剂，则

对照组应给等量的赋形剂；如赋形剂或溶媒可能产生毒性时，还需另设空白对照组（如：水）。

3.1.3.2.2受试物

对于毒性较小的受试物，急性毒性试验时，最大限度提高受试物给药剂量，也不能达到动物中毒死

亡的情况下，大鼠的长期毒性试验可仅设高低两个剂量组，高剂量组应相当于临床剂量50倍以上（按千

克/体重计算）。如因受试物体积过大，达不到这一要求时，最低不能低于临床剂量的30倍，且必须高

于功效学试验的高剂量组。

3.1.3.2.3给药途径及方法

灌胃最好每天一次，每周七天连续给受试物。但如试验周期超过90d，可以考虑每周给受试物6d。

每天给受试物时间应相同。给予受试物剂量应根据动物体重不断调整。对于受试物给药容积，大鼠灌胃

量一般为1ml～2ml/100gBW，各剂量组间应采用等容量不同浓度给予受试物。给予受试物周期不应少

于使用期的2倍～3倍，最长不超过半年。对急性毒性较低，难以测定LD50而用量大于20g/kg的受试物，

使用期限不超过2周者，可免作长期毒性试验。

3.1.3.2.4饲养条件

饲养环境温度20℃～25℃，相对湿度60%±5%，通风良好，光照规律，环境清洁。试验动物应雌、

雄分开，一般每笼最多不宜超过5只，必要时应单笼饲养。各个剂量组和对照组的饲养条件等同。

3.1.3.3观察指标

3.1.3.3.1一般状况和毒性症状

一般状况和毒性症状有：

a)死亡：死亡是动物最明显的表现，但须注意鉴别确系受试物中毒死亡，而与自然死亡或意外

死亡区别开来。发现死亡动物应立即进行尸检，寻找死亡原因。最好在动物中毒临终前活杀

检查，如在死亡后检查，可能会受死亡后的自溶现象（autolysis）干扰；

b)饲料和饮水量消耗：应每周记录，并与体重变化对照观察；

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c)体重变化情况：应每周称量、记录；

d)毒性症状：给受试物后应每天注意有无毒性症状出现，专人负责观察和记录。尤其在给受试

物第一周内，毒性症状出现最多，必须严密观察，及时发现。如一般行为，运动功能，呼吸

的频率和性质，有无腹泻、腹痛、便血、眼、耳、鼻、口腔、外阴部有无异常或分泌物。群

养时应将发现中毒反应的动物及时取出单笼饲养，重点观察。毒性症状有些只在给受试物后

的一定阶段出现，以后逐渐自行消失或减轻；有些则随时间而进行性发展。因此必须列表逐

日或逐周（逐个动物）记录，以便看出症状发生、发展的过程，以及各种症状出现的先后次

序。

3.1.3.3.2血液学指标

测定红细胞、白细胞、血红蛋白、白细胞分类、血小板和凝血时间。急性毒性试验未发现明显毒

性者，可简化为测定红、白细胞计数，白细胞分类和血红蛋白含量。

3.1.3.3.3血液生化学指标

测定天门冬氨酸氨基转换酶、丙氨酸氨基转换酶、碱性磷酸酶、尿素氮、总蛋白、白蛋白、血糖、

总胆红素、肌酐、总胆固醇。急性毒性试验未发现明显中毒者，至少应测定肝、肾功能各两项敏感指标。

3.1.3.3.4尿液检查

测定隐血、蛋白质、糖、尿胆红素。

3.1.3.3.5系统尸解和病理组织学检查

系统尸解和病理组织学检查有：

a)系统尸解：复称体重后尸解，观察要全面细致，发现异常的器官应重点进行病理组织学检查；

b)脏器称重和计算脏器系数：心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、辜丸、卵巢和可能的靶器

官称重并计算脏器系数。急性毒性试验未发现明显毒性者，至少应测心、肝、脾、肺、肾五

个实质脏器的重量并按式（2）计算脏器系数；

m

k=1.........................................(2)

m2

式中：

k——脏器系数；

m1——脏器重量，g；

m2——体重，g。

c)病理组织学检查：取材后立即放进10%福尔马林中固定。并根据所含中药的性、味、功效可

先作高剂量组和对照组的组织学检查，其他剂量组可取材10%福尔马林中固定保存，在高剂

量组有异常时再进行检查。

3.1.3.3.6可逆性观察

末次给予受试物后24h，每组活杀部分动物（2/3～1/2），按以上要求检测各项指标。余下动物停

止给予受试物，继续观察2～4周，观察内容与给受试物期间相同，最后活杀检查，系统尸解和病理组织

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DB22/T396—2014

学观察项目也同前。将所有各项指标同停受试物前比较，以了解毒性反应的可逆程度和可能出现的延迟

性毒性反应。

3.1.3.4结果评价

经口长期毒性试验结果应结合前期试验结果，并考虑到毒性效应指标和尸检及病理组织学检查结果

进行综合评价。毒性评价包括受试物染毒剂量与是否出现毒性反应、毒性反应发生率及其程度之间的关

系。这些反应包括行为或临床异常、肉眼可见损伤、靶器官、体重变化情况、死亡效应以及其它一般或

特殊的毒性作用。将各剂量组动物观察指标与阴性对照组加以比较并进行统计学检验，注意各剂量组间

的剂量-反应(效应)关系。评价受试物最小观察到有害作用剂量和最大未观察到有害作用剂量及毒性作

用的靶器官。

3.2经皮保健用品毒性试验的试验方法

3.2.1皮肤急性毒性试验

3.2.1.1材料

3.2.1.1.1动物

首选白色家兔，也可用白色豚鼠、大鼠。家兔体重2kg左右；豚鼠300g左右；大鼠200g～300g。

受试动物应皮肤光滑，无损伤，无皮肤病。

3.2.1.1.2受试物

如为膏剂或液体剂型，可直接涂抹于去毛皮肤上。若受试物是固体粉末或散剂，则需加适量水或适

当的赋形剂(如羊毛脂、凡士林、橄榄油等〉混匀，以保证受试物与皮肤良好接触。

3.2.1.2试验方法

3.2.1.2.1皮肤准备

在试验前24h，将动物背部脊柱两侧去毛（采用剪、剃或适宜的脱毛剂），去毛范围约为体表面积

10%左右，方法见附录B，家兔约150cm2，豚鼠和大鼠约40cm2。

3.2.1.2.2受试物给予方法

受试物涂抹后以适当的方法固定，如用无刺激性纱布、胶布或有孔尼龙绷带固定。大鼠或豚鼠也可

用适当大小的橡皮套(剪去手指的橡皮手套)，把整个背部和腹部包住。如受试物是液体，则应在其上复

以聚乙烯薄膜，然后再包扎固定，以防止液体挥发。试验过程中，要注意防止动物舔食受试物。

3.2.1.2.3剂量和分组

一般分3个剂量组，其中一个为赋形剂对照组，两个给受试物组，高剂量组剂量为低剂量的2倍～4

倍。为了提高给受试物剂量可提高浓度或增加24h内给受试物次数。大鼠或豚鼠每组10只，家兔每组4

只，雌雄各半。如果受试物毒性较低，可采用一次限量法，即用10只动物（雌雄各半）皮肤涂抹2000mg/kg

体重剂量，当未引起动物死亡，可考虑不再进行多个剂量的急性经皮毒性试验。

3.2.1.2.4观察指标

实验动物分笼饲养。给予受试物后24h，如未中毒死亡，可用温水或其他无刺激性溶剂除去残留于

皮肤的受试物或赋形剂。继续观察，连续7d，注意动物的全身中毒表现、死亡情况和毒性症状的观察。

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如外观行为、异常运动、精神状态、食欲、大便、肤色、呼吸、异常分泌物等。如有动物死亡，应立即

进行尸检和肉眼观察，当有肉眼可见病变时，则应进行病理组织学检查。如外观行为、异常运动、精神

状态、食欲、大便、肤色、呼吸、异常分泌物等。如有动物死亡，应立即进行尸检和肉眼观察，当有肉

眼可见病变时，则应进行病理组织学检查。

3.2.1.3结果评价

评价试验结果时，应将经皮LD50与观察到的毒性效应和尸检所见相结合考虑，LD50值是受试物毒性分

级和标签标识以及判定受试物经皮肤吸收后引起动物死亡可能性大小的依据。引用LD50值时一定要注明

实验动物的种属、性别、染毒途径、观察期限等，评价应包括动物接触受试物与动物异常表现(包括行

为和临床改变、大体损伤、体重变化、致死效应与其它毒性作用)的发生率和严重程度之间的关系。毒

性分级见表4。

表4皮肤毒性分级

级别LD50（mg/kg）

极毒＜5

剧毒≥5～44

中等毒≥44～350

低毒≥350～2180

微毒＞2180

3.2.2皮肤长期毒性试验

3.2.2.1材料

3.2.2.1.1动物

选用成年健康家兔、豚鼠或大鼠。家兔体重2kg左右；豚鼠300g左右，大鼠200g～300g。受试

动物应皮肤光滑，无损伤。

3.2.2.1.2受试物

按3.2.1.1.2进行。

3.2.2.2实验方法

3.2.2.2.1剂量和分组

一般设高、低两个剂量组和一个对照组。皮肤给受试物的高剂量组应是使动物产生严重毒性反应或

有少数动物死亡的剂量，低剂量组应当相当或略高于功效学的有效剂量。但如皮肤急性毒性试验剂量超

过临床用量20倍未出现毒性反应及死亡者，可设一个相当于临床20倍以上的高剂量组和一个对照组。每

组应设家兔6只，如用大鼠或豚鼠，每组应设10只。

3.2.2.2.2动物皮肤给受试物方法

皮肤准备、涂抹受试物和固定方法按3.2.1.2.1及3.2.1.2.2进行。每周给受试物七次，每日一次，

每次至少接触6h。实验周期，给受试物时间不少于使用周期的两倍。

3.2.2.2.3观察指标

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DB22/T396—2014

给受试物停止后，留下部分（约1/3）动物继续观察2周，观察毒性反应可逆程度，其他动物全部处

死。并作血液学生化学和病理学检查，但病理组织学检查中，受试物涂抹的局部皮肤应列为检查的一个

重要对象。

3.2.2.3结果评价

经皮长期毒性试验结果应结合前期试验结果，并考虑到毒性效应指标和尸检及病理组织学检查结果

进行综合评价。毒性评价包括受试物染毒剂量与是否出现毒性反应、毒性反应发生率及其程度之间的关

系。这些反应包括行为或临床异常、肉眼可