DB6111/T 133-2019 谷子杂交种快速鉴定技术规范

ICS65.020.99

B61

DB6111

杨凌农业高新技术产业示范区地方标准

DB6111/T133—2019

谷子杂种快速鉴定技术规范

TechnicalSpecificationforRapidIdentificationofFoxtailMilletHybrids

2019-08-15发布2019-09-01实施

杨凌示范区市场监督管理局发布

DB6111/T133—2019

前言

本规范依据GB/T1.1-2009给出的规定起草。

本规范由杨凌示范区农业标准化技术委员会提出并归口。

本规范起草单位：西北农林科技大学。

本规范主要起草人：冯佰利、袁雨豪、杨璞、高小丽、王鹏科、高金锋、宋慧、梁鸡保。

有关专利的说明按照GB/T1.1-2009中附录C进行。

本规范首次发布。

I

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谷子杂种快速鉴定技术规范

1范围

本规范规定了谷子杂种快速鉴定的术语和定义、鉴定步骤及鉴定结果汇总。

本规范适用于谷子F1代杂合单株的鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T8232粟（谷子）GB/T8232

GB/T30988多酚类植物基因组DNA提取纯化及测试方法GB/T30988

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

亲本linesParents

杂交育种中所选用的雌雄性个体。

3.2

杂种F1Hybrid

采用温汤杀雄、阳光杀雄或人工去雄等方法去雄后授粉，获得的F1种子。

3.3

SSR标记markerRepeatsSequenceSimple

一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，是一类由几个核苷酸（一般为1～6个）为重复单位组

成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。

4鉴定步骤

4.1基因组DNA提取

选取符合GB/T8282的谷子杂交种，参照GB/T30988提取基因组DNA，用超微量分光光度仪测定DNA

含量，用ddH2O稀释到所需工作浓度（30ng/μL）。试验所用试剂见附录A。

4.2PCR扩增反应体系和程序

1

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4.2.1扩增体系

反应总体积10μL，其中模板DNA样品（30ng/μL）2μL，10×buffer（Mg2+）1PCRμL，dNTPs（2.5

mmol/L）1μL，PrimerF（10μmol/L）0.5μL，PrimerR（10μmol/L）0.5μL，TaqE（5U/μL）0.1μL。

试验所用试剂见附录A。

4.2.2反应程序

将反应体系混匀后进行PCR扩增：95℃预变性3min，95℃变性30s，50℃～65℃退火45s，72

℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸10min，16℃保存。将扩增后的PCR产物加入2μL非变性6×Loading

buffer，混合均匀，短时间内置于4℃保存，长时间内置于-20℃保存备用。扩增产物用8%聚丙烯酰

胺检测。

4.3聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

4.3.1制胶

洗涤：将A、B板洗涤至清水无阻力流下，竖立晾干。

封底：每板15ml8%聚丙烯酰胺，加入150μL10%过硫酸铵和15μL四甲基乙二胺，聚合1min。

分离胶：每板258%聚丙烯酰胺，加入100mlμ%过硫酸铵和5010LμL四甲基乙二胺，聚合1h。

4.3.2电泳

待凝胶1h后，将与6×Loadingbuffer混合后的PCR扩增产物每个点样孔加入3μL。电泳缓冲液为

1×TBE，150V～180V恒压条件下电泳1.5h～2h。

4.3.3银染

固定：将完成电泳的胶块放入固定液中，振摇12min以上。

银染：固定完成后，倒出固定液，加入银染液，振摇12min。

脱色：银染完成后，倒出银染液，加入ddH2O，振摇1min。

显影：脱色完成后，倒出ddH2O，加入300mL现配的显影液，待谱带清晰（以Marker为准）后照相

并记录带型。

4.3.4亲本间多态性SSR标记筛选

用附录B中的SSR引物进行PCR扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，筛选出亲本间差异性标记。结果

记录见表1。

表1亲本间多态性引物记

引物编号所在染色体位置多态性引物位点数

4.3.5F1杂合性鉴定

用亲本间存在差异的标记，对相应F1进行单株检测。同时具有父母本的条带或只具有父本条带的为

真杂种；仅具有母本条带的为假杂种。结果记录见表2。

2

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表2F1多态性检测结果记载表

杂交组合号母本父本SSR引物组合F1基因型

5鉴定结果汇总

所有鉴定数据、表格、图片整理后归档保存。保存F1真杂种及对应的亲本组合。

3

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AA

附录A